6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

а также практические навыки выполнения микроскопических исследований каждого слушателя курса для того, чтобы определить пробелы в знаниях. Предполагается, что слушатели знакомы с микроскопией КУМ.

После демонстрационных процедур по приготовлению красителей ведущий предлагает подготовить несколько препаратов из диагностического материала. В ходе занятия преподаватель или ассистент демонстрирует приготовление препаратов:

1)Группу препаратов с отрицательными мазками из любых образцов мокроты слизисто-гнойной фактуры, окрасив их только 0,3%-ным раствором метиленового синего.

2)Группу препаратов с положительными мазками из клинического

материала (мокроты) с нагруженностью КУМ на: 3+, 2+, 1+. Затем преподаватель напоминает участникам курса о том, как

следует выполнять микроскопическое исследование препаратов, и каким образом следует проводить количественную оценку полученных результатов.

Далее слушатели разбивается на 3–4 группы для практического освоения полученных знаний и самостоятельной подготовки к микроскопическим исследованиям.

Демонстрационное приготовление красителей для окраски по методу ЦН:

Раствор 1. Насыщенный спиртовой раствор фуксина:

–растереть в ступке 0,3 г основного фуксина с 2–3 каплями глицерина, добавить по каплям 10 мл 96° этилового спирта.

Раствор 2. Рабочий раствор фенола (5% водный раствор):

–расплавить 5 г кристаллического фенола путем легкого подогревания на водяной бане (температура плавления фенола – 41°С). Добавить слегка подогретую дистиллированную воду до объема 100 мл.

Раствор 3. Рабочий раствор карболового фуксина:

–в 90 мл раствора 2 добавить 10 мл раствора 1.

Раствор 4. Обесцвечивающие растворы: а) Раствор серной кислоты

К 75 мл дистиллированной воды осторожно долить 25 мл концентрированной серной кислоты, постепенно наслаивая ее по стенкам сосуда. Смешать. Содержимое нагреется.

б) Раствор солянокислого спирта Вместо раствора серной кислоты для обесцвечивания можно

использовать 3% солянокислый спирт:

К 97 мл спирта осторожно добавить 3 мл концентрированной соляной кислоты.

Раствор 5. Рабочий раствор метиленового синего:

– растворить 0,3 г хлорида метиленового синего в 100 мл дистиллированной воды.

Преподаватель демонстрирует технику микроскопирования препаратов и обращает внимание слушателей на правила оценки результатов исследований.

Вконце занятия преподаватель проводит разбор ошибок, допущенных в ходе приготовления, окрашивания и микроскопирования препаратов из нативной мокроты.

Вкачестве задания преподаватель со слушателями разбирает возможные причины ошибок при проведении микроскопии и предлагаемые пути их решения в виде дискуссии по следующей схеме.

Заключительная часть (10 мин)

Подводя итог, обращается внимание слушателей на организацию рабочих мест по микроскопии, их эргономику, демонстрируется ведение учетно-отчетной документации по ведению раздела микроскопии в лаборатории.

Рекомендуемая литература

1.Определитель бактерий Берджи. Под ред. Дж. Хоулта. – М., 1997. – Девятое издание. – Т.2. – С. 606–612.

2.Практическое руководство по биологической безопасности в лабораторных условиях. 2–ое изд. – Всемирная Организация Здравоохранения. – Женева: 1994. – 146 с.

3.Приказ МЗ РФ от 12.01.1999г. № 8 «О введении в действие Положения о порядке инспекционного контроля за деятельностью

Раздел 3. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

клинико-диагностических и экспертных лабораторий в здравоохранении».

4.Приказ МЗ РФ от 21.03.2003 г. №109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации», Приложение 10.

5.Приказ МЗ РФ от 25.12.1997 г. №380 «О состоянии и мерах по совершенствованию лабораторного обеспечения диагностики и лечения пациентов в учреждениях здравоохранения Российской Федерации».

6.Приказ МЗСР РФ от 2.10.2006 г. № 690 «Об утверждении учетной документации по выявлению туберкулеза методом микроскопии».

7.Приказ МЗСР РФ от 29.12.2010 г. №1224н «Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи больным туберкулезом в Российской Федерации».

8.Пузанов В.А., Николаева Г.М. Тинкториальные особенности микобактерий при использовании стандартных и нетрадиционных методов окраски // Проблемы туберкулеза. – 1994. – № 1.

– С. 31–35.

9.Санитарно-эпидемиологические правила «Безопасность работы с микроорганизмами III–IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» (СП1.3.2322-08).

10.Фтизиатрия. Национальное руководство. Под ред. М.И. Перельмана. – М., 2007.

11.Ba F., Rieder H.L. A comparison of fluorescence microscopy with the Ziehl-Neelsen technique in the examination of sputum for acidfast bacilli // Int. J. Tuberc. Lung. Dis. – 1999. – V. 3(12). – P. 1101– 1105.

12.Collins C.H., Grange J.M., Yates M.D. Tuberculosis Bacteriology. 2nd ed. Organization and Practicе. Oxford: Butterworth-Heinemann, 1997.

13.Enarson D.A., Rieder H.L., Arnadottir T. – Technical Guide for Sputum Examination for Tuberculosis by Direct Microscopy. IUATLD.

– 1994. – P. 49–64.

14.Laboratory services in tuberculosis control. Part I: Organization and management. – 1998. – 64 pp.

15.Laboratory services in tuberculosis control. Part II: Microscopy. – 1998. – 62 pp.

16.Neelsen P. Zentralblatt fur de Medizinischen Wissenschafen – 1883.

– V.21. – P. 497.

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Тема 2.3. Настройка и эксплуатация микроскопов. Вспомогательное лабораторное оборудование

Практическое занятие

Количество аудиторных часов – 2

Примерный план занятия

Практическое занятие проводится в интерактивной форме. Учитывается знания курсантов, полученные на лекциях, семинарских занятиях, а также полученные базовые знания слушателей на этапе самоподготовки модуля 2 «Микроскопические методы диагностики кислотоустойчивых микобактерий» тема 2.1. «Световая, люминесцентная и LED-микроскопия» и тема 2.2. «Обеспечение качества микроскопических исследований», а также модуля 1. «Основные биологические характеристики микроорганизмов рода Mycobacterium» темы 1.4 «Обзор микробиологических методов изучения микроорганизмов рода Mycobacterium и их место в диагностике туберкулеза».

•В ходе практического занятия рекомендуется разобрать: Правила настройки микроскопов для световой микроскопии в

•проходящем свете с иммерсионными объективами Правила настройки микроскопов для люминесцентной микроскопии с ртутной лампой и с LED-источником света;

Цель – дать слушателям практические навыки настройки мик-

роскопов для выявления кислотоустойчивых микобактерий

Вводная часть (20 мин)

Перед изложением основной части занятия ведущий в интерактивной форме обсуждает со слушателями основные части и правила работы со световым микроскопом, правила работы с препаратом и т.д.

Составные части микроскопа:

–Окуляры в бинокулярной насадке;

–Револьвер для крепления объективов;

–Объективы;

–Препаратоводитель и препаратодержатель);

–Предметный столик микроскопа;

–Ирисовая апертурная диафрагма;

–Конденсор;

–Кронштейн конденсора;

–Полевые линзы и диафрагма;

–Световой фильтр;

–Набор полевых линз;

–Регулирующий винт движения предметного столика (макровинт);

–Регулирующий винт движения предметного столика (микровинт);

–Светильник с галогеновой лампой.

В ходе практического занятия слушатели приобретают умения настраивать микроскоп и использовать его в практической работе.

Основная часть (60 мин)

В основной части ведущий последовательно излагает алгоритм настройки светового микроскопа с микроскопией по Кёллеру, а затем настройку микроскопов для люминесцентной микроскопии.

Далее разбивает слушателей на 2 группы для практического освоения полученных знаний в ходе демонстрации правил настройки микроскопов. 1 группа осваивает настройку светового микроскопа, 2 группа – люминесцентный микроскоп. Затем группы меняются местами.

Задание 1.

Настройка освещения светового микроскопа по Кёллеру (на примере микроскопа Микмед-2 вар. 2 или 6):

•Включить освещение микроскопа, отрегулировав его на малое напряжение, которое используется при работе с малым увеличением. Для этого используют ручку реостата, совмещенного с выключателем.

•Совместить оптические оси наблюдения объекта и подсветки, регулируя их положение соответствующими винтами микроскопа

•Отрегулировать четкость изображения левого и правого окуляра.

Этой манипуляцией завершается настройка светового микроскопа.

Многие современные микроскопы оснащены центрированными и неподвижными конденсорами, что облегчает процедуру настройки. Регулировка осуществляется только с помощью открытия апертуры ирисовой диафрагмы до 70–80%, что обеспечивает равномерное освещение поля зрения.

Задание 2.

Настройка микроскопов для люминесцентной микроскопии с ртутной лампой и с LED-источником света. В качестве примера

Раздел 3. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

приводится настройка люминесцентного микроскопа, как наиболее сложного в эксплуатации.

Настройка люминесцентного осветителя в следующем порядке:

•ввести блок светофильтров, рекомендуемых производителем для окраски ауромином и родамином, опустить светозащитный экран;

•настроить изображение световой дуги ртутной лампы по рекомендации производителя;

•установить контрольный препарат и проверить качество и яркость свечения микобактерий (они должны быть хорошо видны в виде желто-оранжевых объектов на темно-зеленом фоне при увеличении х400).

Если в конструкции микроскопа предусмотрено контрольное

окно, то следует проконтролировать положение изображения дуги лампы с помощью этого окна, – изображение дуги должно находиться в центре контрольного круга.

Некоторые производители разрабатывают самонастраивающиеся узлы крепления ртутной лампы НВО 100. Люминесцентный осветитель настраивается по принципу Кёллера с помощью апертурной и полевой диафрагмы.

Практические рекомендации по организации рабочего места для люминесцентной микроскопии.

Лучше всего работать в затемненном помещении. Во время работы не следует выходить в светлые помещения, смотреть на свет лампы или на светлые окна. Температура в помещении не должна превышать 25 °С. Микроскоп с ртутной лампой должен быть установлен на столе и удален от стен на расстояние не менее 30–50 см.

Теплозащитный светофильтр: люминесцентные светофильтры чувствительны относительно исходящего от лампы теплового излучения. Поэтому ни в коем случае нельзя устранять встроенный тепловой светофильтр.

Вспомогательным лабораторным оборудованием для раздела «Микроскопия» являются:

•вытяжной шкаф и шкаф биологической безопасности, класс 1

•весы

•дистиллятор воды

•сухожаровой шкаф

•фиксатор мазков

Правила эксплуатации данного оборудования изложены в сопроводительных инструкциях и, кроме того, в разделе 6.4.

Заключительная часть (10 мин)

Подводя итог, обращается внимание слушателей, на значение

инеобходимость использования методов микроскопии в алгоритме обследования пациентов с подозрением на туберкулез органов дыхания, больных туберкулезом на различных этапах лечения

иреабилитации. Владение техническими знаниями настройки и эксплуатации микроскопов является важным компонентом профессиональной подготовки врача-бактериолога.

Рекомендуемая литература

1.Приказ МЗ РФ от 21.03.2003г. №109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации», Приложение 10.

2.Унифицированный метод микроскопического выявления кислотоустойчивых микобактерий: Руководство для клинико-ди- агностических лабораторий лечебно-профилактических учреждений / В.В.Ерохин, В.И.Голышевская, С.А.Попов, В.А.Пузанов, Г.В.Евгущенко, Э.В.Севастьянова, Л.П.Мартынова, О.А.Иртуганова. – М.–Тверь: Триада, 2008. – 132 с.

3.AFB microscopy training. A.Fujiki. – Tokyo. – 2005. – 84 p

4.Laboratory services in tuberculosis control. Part I: Organization and management. – 1998. – 64 pp.

5.Laboratory services in tuberculosis control. Part II: Microscopy. – 1998. – 62 pp.

Материально-техническое обеспечение

Для проведения практического занятия должны быть подготовлены для демонстрации оборудование и микроскопы для обучения. Флип-чарт, маркеры, фломастеры, мультимедийное оборудование.

Раздел 3. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

МОДУЛЬ 3. Культуральные методы выявления

иидентификации возбудителя туберкулеза

имикобактериозов

Тема 3.3. Правила посева, культивирования, идентификации и интерпретации результатов

Практическое занятие

Количество аудиторных часов – 2

Примерный план занятия

Практическое занятие проводится в интерактивной форме. Учитывается знания курсантов, полученные на лекциях, семинарских занятиях, а также полученные базовые знания слушателей на этапе самоподготовки изложенные в темах модуля 1. «Основные биологические характеристики микроорганизмов рода Mycobacterium» темы 1.3. «Характеристика и таксономия микроорганизмов рода Mycobacterium» и темы 1.4 « Обзор микробиологических методов изучения микроорганизмов рода Mycobacterium и их место в диагностике туберкулеза», а также модуля 3. «Культуральные методы выявления и идентификации возбудителя туберкулеза и микобактериозов» тема 3.1 «Правила сбора, транспортировки, обработки и хранения диагностических материалов», тема 3.2. «Питательные среды: характеристики и правила приготовления» и тема 3.3. Правила посева, культивирования, идентификации и интерпретации результатов».

В ходе практического занятия рекомендуется разобрать сле-

•дующие вопросы:

Кросс-контаминация при проведении культуральных исследований и правила работы в шкафах биологической безопасно-

•сти;

•Посев и особенности культивирования микобактерий; Интерпретация и учет результатов посева диагностического ма-

•териала; Первичная идентификация МБТ на основе культуральных

свойств. Видовая дифференциация M.tuberculosis complex от нетуберкулезных микобактерий (например, методом иммунохроматографии).

Цель – продемонстрировать слушателям практические навыки

работы при осуществлении процедур посева, культивирования, биохимических методов идентификации микобактерий различных видов, интерпретации и учета результатов. Знакомство с алгоритмом проведения исследований. Разбор наиболее частых ошибок при осуществлении перечисленных процедур и методов.