6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Архитектурно – планировочные решения и размещение оборудования должны обеспечивать поточность движения исследуемого материала.

Зонирование рабочих помещений

Лаборатория в соответствии с этапами проведения анализа должна включать следующий минимальный набор последовательно расположенных самостоятельных рабочих зон (помещений) или отдельно выделенных рабочих зон в составе других функциональных помещений, количество которых определяется используемыми методами:

Рабочие зоны

•Приема, регистрации, разбора материала (Рабочая зона 1): прием материала, маркировка, регистрация.

•Первичной обработки материала, выделение ДНК\РНК (Рабочая зона 2): первичная подготовка (концентрирование материала), объединение или разделение проб на аликвоты, обеззараживание и хранение проб, обеззараживание остатков исследуемого материала, выделение и очистка нуклеиновых кислот микобактерий.

•Приготовления реакционных смесей (Рабочая зона 3): приготовление реакционных смесей, для амплификации нуклеиновых кислот. Рекомендуется разделять Рабочую зону 3 на две подзоны (3а и 3б) и разместить их в отдельных помещениях.

o Приготовление реакционных смесей (Рабочая зона 3а): приготовление реакционных смесей, с нуклеиновыми кислотами из проб, подготовленных в Рабочей зоне 2.

o Проведение реакции амплификации и учет ее результатов (Рабочая зона 3б): при использовании гибридизационофлюоресцентного метода детекции

•Учета результатов реакции амплификации нуклеиновых кислот методом электрофореза и (или) гибридизационно-ферментным методом детекции (Рабочая зона 4).

•Учета результатов амплификации нуклеиновых кислот методом гибридизации на ДНК-стрипах или на ДНК-чипах (Рабочая

зона 4а).

Рабочие зоны 4 и 4а располагают изолировано от Рабочих зон 1–3 для предотвращения их контаминации продуктами амплификации через воздушный поток. Объединение Рабочих зон 4 и 4а за-

прещено.

Вспомогательные помещения

В состав лаборатории должны быть включены вспомогательные помещения (комнаты персонала, кабинет заведующего лабораторией, раздевалки для сотрудников, комната приема пищи, туалет, подсобные (складские) помещения), которые должны быть вынесены за пределы рабочей зоны.

Вспомогательные помещения должны располагаться отдельно от рабочих зон (помещений) в соответствии с действующими санитарными правилами, регламентирующими обеспечение безопасности работ с микроорганизмами III–IV группы патогенности.

Необходимо предусмотреть наличие автоклавной комнаты для обеззараживания исследуемого материала, которая может быть общей с другими подразделениями учреждения при условии соблюдения требований биологической безопасности.

Оснащение рабочих помещений

Вентиляция помещений

Помещения лаборатории оборудуют приточно-вытяжной вентиляцией в соответствии с СП 1.3.2322-08.

ВРабочей зоне 3 объем приточного воздуха должен соответствовать объему на вытяжке.

ВРабочих зонах 1 и 2 вытяжка должна преобладать над прито-

ком.

Рабочие зоны 4 и 4а рекомендуется оборудовать автономной системой приточно-вытяжной вентиляции. Вытяжка должна преобладать над притоком.

При разделении зоны 3 на подзоны 3а и 3б, приточно-вытяж- ная вентиляция в них должна быть выполнена раздельно для подзоны 3а и для подзоны 3б.

Вусловиях жаркого климата разрешается установка кондиционеров в помещениях рабочих зон лаборатории, при условии их выключения на время проведения работ, с последующей дезинфекционной обработкой рабочего места.

Лабораторное оборудование, мебель

Каждая самостоятельная рабочая зона должна быть оснащена минимальным набором соответствующего лабораторного оборудования в зависимости от их функционального назначения и риска контаминации, необходимым комплектом мебели, пластиковой и стеклянной посуды, расходных материалов, защитной одежды и

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

10.Морозильная камера на минус 70°С (при необходимости, в случае длительного хранения диагностического материала).

11.Емкость для дезинфицирующего раствора.

12.При исследовании материала, подозрительного на зараженность возбудителями III–IV групп патогенности, допускается использование автоматизированного оборудования для выделения нуклеиновых кислот.

Рабочая зона 3 – приготовление реакционной смеси

1.Бокс биологической безопасности I класса.

2.Микроцентрифуга/вортек с.

3.Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема

– 10–100 мкл, 100–200 мкл, 200–1000 мкл.

4.Штативы для пипеток, наконечников, микропробирок.

5.Комбинированный холодильник с камерами, поддерживающими температуру от 2 до 8°С и минус 20°С (для хранения реагентов).

Рабочая зона 3а – приготовление реакционной смеси

1. Бокс биологической безопасности I класса.

2. Микроцентрифуга/вортекс.3. Отдельный набор автоматических пипеток

переменного объема – 10–100 мкл, 100–200 мкл, 200–1000 мкл.

4.Штативы для пипеток, наконечников, микропробирок.

5.Комбинированный холодильник с камерами, поддерживающими температуру от 2 до 8°С и минус 20°С (для хранения реагентов).

Рабочая зона 3б – проведение реакции амплификации и учета

ее результатов при использовании гибридизационно – флюоресцентного метода детекции. В данной зоне возможна регистрация результатов, выписка ответов на бланке, ведение общелабораторной базы данных при условии сетевого подключения компьютера

1.Программируемые термоциклеры (персональные, многомодульные, с функцией амплификации в режиме «реального времени») и автоматизированные станции. Выбор термоциклера или автоматизированной станции определяется методами амплификации нуклеиновых кислот и коммерческими наборами реагентов, используемыми в лаборатории, характером выполняемых задач и финансовыми возможностями.

2.Флюориметр (флюоресцентный детектор), только при учете продуктов амплификации гибридизационно – флюоресцентным методом детекции по конечной точке.

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

3.Компьютеры к соответствующим приборам программным обеспечением, антивирусной программой, принтер, источник бесперебойного питания.

Рабочие зоны 4 и 4а – анализ продуктов амплификации

1.Гибридизационная печь.

2.Прибор для гибридизации на стриповых мембранах.

3.Прибор для анализа ДНК-чипов.

4.Автоматические приборы для гибридизации

6.Компьютеры с соответствующим приборам программным обеспечением, антивирусной программой, принтером. Источник бесперебойного питания должен быть связан через компьютерную сеть с компьютером, располагающимся в чистой зоне и предназначенным для анализа результатов.

7.Камера для горизонтального электрофореза.

8.Источник постоянного тока с напряжением 150–460 В.

9.Ультрафиолетовый трансиллюминатор с кабинетом для просмотра гелей.

10.Видеосистема с цифровой видеокамерой для регистрации результатов.

11.Микроволновая печь или другой нагревательный прибор для плавления агарозы.

12.Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема

– 10–100 мкл, 100–200 мкл, 200–1000 мкл. 13.Штативы для пипеток, наконечников, микропробирок.

14.Колба коническая из термостойкого стекла для плавления агарозы.

15.Мерные цилиндры объемом 100 мл и 1000 мл. 16.Столик и набор гребенок для приготовления геля. 17.Емкость для сбора отработанных расходных материалов.

18.Холодильник с камерой, поддерживающей температуру от 2 до 8°С (для хранения наборов реагентов).

Расходные материалы

1.Наборы реагентов для выделения ДНК/РНК.

2.Наборы реагентов для амплификации ДНК/РНК.

3.Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с фильтром до 200 и до 1000 мкл.

4.Микропробирки – 0,2 мкл, 0,6 мкл, 1,5 мкл (в зависимости от формата используемого метода, пробирки могут быть тонкостенные, толстостенные, с плоскими или выпуклыми крышками, для ПЦР-РВ требуется оптически-прозрачные пробирки).

Тема 12.3. «Меры по предотвращению контаминации в лаборатории, использующей молекулярно-генетические методы»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план семинарского занятия

Вопросы, прорабатываемые на семинаре:

•Соблюдения поточности движения биоматериала

•Деконтаминационная обработка оборудования и помещений Цель семинара – ознакомление слушателей с мероприятиями

по предотвращению контаминации в лаборатории молекулярногенетических методов исследования.

Семинар проводится в интерактивной форме. При обсуждении темы семинара ведущий и слушатели используют материалы методических указаний и санитарно-эпидемических правил, регламентирующих молекулярно-генетические исследования и работу с патогенами III–IV группы.

Вводная часть (5–10 мин)

Ведущий семинара обсуждает со слушателями рабочий план и с учетом самоподготовки определяет тему дискуссии. Правила предотвращения контаминации, которые регламентируются санитарными правилами «Безопасность работы с микроорганизмами III–IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» СП 1.3.2322-08, методическими указаниями «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности» МУ 1.3. 2569-09.

исанитарно-эпидемиологическими правилами «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I–IV групп патогенности» СП 1.2.036-95, Госкомсанэпиднадзор России, 1995. Рекомендуется также углубить представление об "инфекционном контроле", "санитарно-противоэпидемическом режиме",

и"стандартных универсальных мерах предосторожности".

Основная часть (30 мин)

Работа начинается с выбора основной темы дискуссии. В ходе дискуссии на выбранную тему ведущий делает необходимые пояснения и добавления. Например, фиксирует внимание слушателей на такие понятия, как «аварийная ситуация» и «риск контаминации»; детально разбирает характеристику рисков профессионального заражения туберкулезом медицинских работ-

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ