6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

венной чувствительности к ПТП, встречаются достоверно реже, чем в группе больных, ранее получавших лечение.

Для гена rpoB (данные ЦНИИТ РАМН, рис. 1):

Для гена katG (данные ЦНИИТ РАМН, рис. 2)

Для гена gyrA (данные ЦНИИТ РАМН, рис. 3)

Эти результаты хорошо коррелируют с данными по фенотипической чувствительности МБТ, показывающими, что среди впервые выявленных больных устойчивого туберкулеза встречается достоверно ниже, чем чувствительного и наоборот, среди ранее леченных больных частота встречаемости устойчивых штаммов МБТ существенно выше, чем чувствительных.

Также следует отметить, что разнообразие мутаций у штаммов МБТ, выделенных от ранее получавших лечение больных достоверно выше, чем у штаммов МБТ, выделенных от впервые выявленных больных.

Спектр мутаций в гене rpoB

Характерной чертой штаммов МБТ с устойчивостью к рифампицину, распространенных в Российской Федерации и во многих других странах является превалирование мутации в 531 кодоне гена rpoB (rpoB 531Ser->Leu, около 40% от всех вариантов мутаций у впервые выявленных больных и около половины от всех вариантов мутаций у ранее леченных больных). На втором месте по распространенности вариант мутации в 516 кодоне гена rpoB (rpoB 516Asp->Val, около 2% от всех вариантов мутаций у впервые выявленных больных и около половины от всех вариантов мутаций у ранее леченных больных).

Спектр мутаций в генах, детерминирующих устойчивость к изониазиду

Спектр мутаций, детерминирующих устойчивость к изониазиду, распределился следующим образом: штаммы МБТ с устойчивостью к изониазиду, полученные от впервые выявленных больных, имеют в 42,11% случаев мутации в 315 кодоне гена katG (katG315Ser->Thr), штаммы МБТ, выделенные от ранее леченных больных имели мутации в этом же кодоне в половине случаев.

Для штаммов с ШЛУ, выделенных от впервые выявленных и ранее леченных больных, превалирующей была мутация в гене gyrA в 94 кодоне (gyrA 94Asp->Gly).

Спектр мутаций в генах, детерминирующих устойчивость к фторхинолонам

Для штаммов МБТ, выделенных от впервые выделенных больных, наиболее распространенной мутацией в генах, кодирующих гиразу, находились в 94 кодоне gyrA (Asp->Gly) – 3,53%.

Для штаммов МБТ, выделенных от ранее леченых больных также было характерно превалирование мутации в том же участке генома, однако процент встречаемости был выше (12,39%).

Спектр сочетанных мутаций у штаммов МБТ с МЛУ (рис. 4 и 5) Спектр сочетанных мутаций, характерный для штаммов МБТ с МЛУ распределился следующим образом: сочетания rpoB 531Ser-

>Leu и katG315Ser->Thr встречаются в подавляющем числе случаев (74% от всех возможных вариантов). Спектр вариантов сочетанных мутаций у МБТ от впервые выявленных больных был существенно однороднее, чем у МБТ, выделенных от ранее леченых пациентов.

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Спектр сочетанных мутаций у штаммов МБТ с ШЛУ (рис. 6 и 7) Впервые выявленные больные чаще всего выделяли ШЛУ МБТ с профилем мутаций в генах rpoB 531Ser->Leu и katG315Ser->Thr

и gyrA 94Asp->Gly (в 26% случаев от всех ШЛУ штаммов МБТ)

Рекомендуемая литература

1.Владимирский М.А., Аляпкина Ю.С., Варламов Д.А., Алексеев Я. И., Шипина Л.К., Шульгина М.В., Домотенко Л.В., Быкадорова К.Р., Гащенко Н.Н., Ендоурова Л.Б., Иванова О.В., Ильина Е.А., ЛевковаО.А., Маркова Т.В., Наземцева В.П., Павлова Е.П., Полозов А.И., Шишкина Н.В. Применение метода ПЦР в реальном времени для определения и контроля за распространением лекарственно-устойчивых штаммов микобактерий туберкулеза // Туберкулез и болезни легких. – 2008. – №4. – С. 38–44.

2.Кузьмин А.В., Васильева И.А., Черноусова Л.Н. Эффективность химиотерапии деструктивного туберкулеза легких, основанной на результатах экспресс-детекции лекарственной чувствительности к изониазиду и рифампицину тест-системой «ТБ-Био- чип» // Проблемы туберкулеза и болезней легких. – 2006. – № 8. – P. 17–23.

3.Носова Е.Ю., Галкина К.Ю., Антонова О.В., Гармаш Ю.Ю., Скотникова О.И., Мороз А.М. Молекулярно-биологический микрочип ТБ-БИОЧИП-2 для определения чувствительности Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной усточивостью к фторхинолонам у больных с впервые выявленным и хроническим течением туберкулеза // Вестник РАМН. – 2008 – Т.3. – С. 16–19.

4.Afanas'ev M.V., Ikryannikova L.N., Il'ina E.N., Sidorenko S.V., Kuz'min A.V., Larionova E.E., Smirnova T.G., Chernousova L.N., Kamaev E.Yu., Skorniakov S.N., Kinsht V.N., Cherednichenko A.G., Govorun V.M. Molecular characteristics of rifampicinand iso- niazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Russian Federation // J. Antimicrob. Chemother. – 2007. – Vol. 59. – P. 1057–1064.

Материально-техническое обеспечение

Демонстрационные / раздаточные материалы, мультимедийная или проекционная демонстрационные системы, экран, лазерная указка.

Тема 11.4. «Значение ускоренных методов детекции ЛУ для* повышения эффективности лечения туберкулеза»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план семинарского занятия

Вопросы, прорабатываемые на семинаре:

•Время установления ЛУ МБТ молекулярно-генетическими и традиционными микробиологическими методами.

•Эффективность лечения туберкулеза по результатам ускоренного определения лекарственной чувствительности МБТ моле- кулярно-генетическими методами.

Цель семинара – формирование у слушателей представлений

об эффективности использования ускоренных методов определения ЛЧ микобактерий для назначения адекватной химиотерапии в короткие сроки.

Семинар проводится в интерактивной форме. При обсуждении учитывается самоподготовка по модулю 11. «Молекулярно-гене- тические основы резистентности микобактерий» темы 11.2 «Мо- лекулярно-генетические методы определения ЛУ МБТ».

Вводная часть (5–10 мин)

Ведущий перечисляет все известные на сегодняшний день методы определения лекарственной чувствительности – микробиологические и молекулярно-генетические.

Основная часть (30 мин)

Ведущий обсуждает со слушателями характеристики существующих методов определения ЛЧ (схема 1). Во второй части семинара преподаватель на примере исследования, проведенного в ЦНИИ туберкулеза РАМН, демонстрирует значение применения быстрых молекулярно-генетических методов исследования для своевременной коррекции курса химиотерапии при лечении МЛУ-туберкулеза.

Заключительная часть

Подводя итог семинара, преподаватель еще раз указывает на то, что правильный подход к выбору методов выявления и определения ЛЧ микобактерий помогает врачам успешно бороться с заболеванием.

*Демонстрационный материал к семинару представлен на диске. Может быть распечатан в качестве раздаточного материала.

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Краткий информационный материал к семинару модуля 11.

«Молекулярно-генетические основы резистентности микобактерий» темы 11.4. Значение ускоренных методов детекции ЛУ для повышения эффективности лечения ТБ».

Исследование эффективности использования молекулярно-гене- тических методов определения ЛЧ МБТ (проф. Васильева И.А. с соавт. Центральный НИИ туберкулеза РАМН).

Проводилась оценка режимов химиотерапии, основанных на раннем выявлении МЛУ МБТ с помощью тест-системы «ТБ-Био- чип», у впервые выявленных больных туберкулезом легких. Все пациенты были разделены на три группы. В первую вошли больные, у которых была определена устойчивость возбудителя к изониазиду и рифампицину (МЛУ МБТ) ускоренным молекулярно-генетиче- ским методом «ТБ-Биочип» в первые дни при поступлении в клинику. Этой группе больных изначально назначался режим химиотерапии из 5-ти препаратов резервного (второго) ряда. Во вторую группу вошли пациенты, выделявшие чувствительные к изониазиду и рифампицину микобактерии по данным экспресс-метода «ТБ-Биочип». Этой группе назначался первый стандартный режим химиотерапии из 4-х препаратов основного ряда. В третью контрольную группу вошли больные с МЛУ МБТ, у которых ЛУ возбудителя была определена традиционным методом абсолютных концентраций спустя 2–3 месяца после начала лечения. Этим больным назначался 1-й режим химиотерапии с последующей коррекцией после получения результатов теста на лекарственную чувствительность (ТЛЧ). При этом установлено, что раннее назначение режима химиотерапии из 5-ти препаратов резервного ряда впервые выявленным больным МЛУ ТБ позволяет добиться высоких результатов лечения в течение первых 6 месяцев – прекращения бактериовыделения у 97,7% и заживления полостей распада у 82,7% больных, что сопоставимо с результатами лечения впервые выявленных больных лекарственно чувствительным туберкулезом (98,8% и 86,7% соответственно). В то же время, запоздалое выявление МЛУ МБТ и назначение адекватного режима терапии спустя 2–3 месяца лечения приводят к замедлению темпов абациллирования мокроты (62,2%) и процессов инволюции воспалительнодеструктивных изменений в легких (57,8%) в эти же сроки соответственно, р <0,05, (рис. 1,2).

Рекомендуемая литература

1.Бастиан И., Порталс Ф. Туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью. – М.: Медицина и жизнь, 2003.

2.Васильева И.А., Черноусова Л.Н., Заседателев А.С., Соболев А.Ю., Михайлович В.М. Клиническое значение микрочиповой технологии определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза // Проблемы туберкулеза. – 2002 – № 6 – С. 21–24

3.Исакова Ж.Т. Практическое значение тест-системы «ТБ-био- чип MDR» в экспресс-идентификации штаммов M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью// Клиническая лабораторная диагностика. – 2009. – № 2. – С. 50–51.

4.Кузьмин А.В., Васильева И.А., Черноусова Л.Н. Эффективность химиотерапии деструктивного туберкулеза легких, основанной на результатах экспресс-детекции лекарственной чувствительности к изониазиду и рифампицину тест-системой – «ТБ-БИО- ЧИП» // Проблемы туберкулеза и болезней легких. – 2006. – №8. – С. 17–23.

5.Hillemann D., Rusch-Gerdes S., Richter E. Evaluation of the GenoType MTBDRplus Assay for Rifampin and Isoniazid Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis Strains and Clinical Specimens// J Clin Microbiol. – 2007. – № 45(8). – Р. 2635–2640.

6.Mitchinson D.A., Nunn A.J. Influence of initial drug resistance on the response to short-course chemotherapy of pulmonary tuberculosis// Am Rev Respir Dis. – 1986. – № 133. – Р. 423–430.

7.Rossman M.D., MacGregor R.R. Tuberculosis: clinical management and new challenges // McGraw Hill Inc., New York, 1995.

Материально-техническое обеспечение

Демонстрационные / раздаточные материалы, мультимедийная или проекционная демонстрационные системы, экран, лазерная указка.

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

МОДУЛЬ 12. Организация лаборатории молекулярногенетических методов исследований

Тема 12.2. «План рабочих зон лаборатории молекулярногенетических исследований и рекомендуемый комплект оборудования»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план семинарского занятия

Вопросы, прорабатываемые на семинаре:

•Основополагающие принципы методик, которые необходимо учитывать при планировке лабораторий, выполняющих моле- кулярно-генетические исследования

•Размещение ПЦР-рабочих зон в условиях бактериологической лаборатории

•Рекомендуемый комплект оборудования для молекулярно-ге- нетических исследований

•Рекомендуемый комплект расходных материалов

•Инженерно-техническое обеспечение исследований

Цель семинара – формирование у слушателей представлений о системе обязательных/необходимых мер для использования моле- кулярно-генетических методов в диагностике туберкулеза и микобактериальных инфекций, а также о значении подобных мероприятий для достижения успехов в применении молекулярных методов.

Семинар строится в свободном по форме неформальном обсуждении. Обсуждаются вопросы организации лаборатории и планировки помещений, выделенных под работы с применением мо- лекулярно-генетических методов исследований. В ходе семинара слушатели приобретают знания и представления о правилах организации лабораторий молекулярно-генетического профиля, принципах размещения рабочих зон, перечнях необходимого оборудования и расходных материалов, инженерно-технических мероприятиях. Рекомендуется отработать следующие практические навыки: Составление схем размещения рабочих зон с учетом поточности движения материала.

Вводная часть (5–10 мин)

Ведущий семинара обсуждает со слушателями рабочий план и с учетом самоподготовки определяет тему дискуссии. Например, законодательные основы, изложенные в санитарно-эпидемиоло- гических правилах «Безопасность работы с микроорганизмами

III–IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» СП 1.3.2322-08, и в методических указаниях «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности» МУ 1.3. 2569–09.

Основная часть (30 мин)

Работа проводится в малых группах и начинается с выбора основной темы дискуссии в группе. Затем ведущий предлагает представителю из каждой группы план условных лабораторных помещений с заданием распланировать размещение лабораторных зон с учетом бактериологической и молекулярно-генетической тематики диагностической работы. В ходе дискуссии на выбранную тему ведущий делает необходимые пояснения и добавления. Например, фиксирует внимание слушателей на факторах, повышающих риск контаминации при работе с пробами.

Заключительная часть

В заключении ведущий семинара подчеркивает, что основным принципом защиты медицинского персонала в ЛПУ является создание безопасной для здоровья производственной среды, обеспечивающей оптимальную адаптацию условий труда к возможностям работника и эффективное управление профессиональными рисками инфицирования туберкулезом и микобактериальных инфекций.

Краткий информационный материал к семинару модуля 12.

«Организация лаборатории молекулярно-генетических методов исследований», тема 12.2. «План рабочих зон лаборатории молекулярно-генетических исследований и рекомендуемый комплект оборудования».

Общие положения

В процессе семинарского занятия необходимо составить представление об основных принципах, заложенных в методики, применяемые для молекулярно-генетической диагностики туберкулеза и микобактериальных инфекций.

Процесс амплификации основан на многократном увеличении числа копий фрагмента нуклеиновых кислот (ДНК/(кДНК)/РНК) или усилении сигнала в условиях in vitro, что позволяет обнаружить специфичный участок генома возбудителя с целью его идентификации.

1.Основной метод амплификации нуклеиновых кислот – полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

2.Разновидности полимеразной цепной реакции: с “горячим” стартом, мультиплексная (мультипраймерная), в режиме “реального времени” (Real-Time PCR), анализ “по конечной точке” и т.д.

3.Методы исследования, использующие продукты амплификации нуклеиновых кислот: секвенирование, ДНК – чипы, рестрикционный анализ.

4.Методы детекции продуктов амплификации нуклеиновых кислот:

•электрофоретический (в агарозном или полиакриламидном геле);

•гибридизационно – ферментный;

•гибридизационно – флюоресцентный (детекция продукта в режиме “реального времени” или регистрация после окончания реакции амплификации (“анализ по конечной точке”)).

5.Форматы исследования: качественный, количественный.

Контаминация – (лат. contaminatio; смешение) попадание в определенную среду какой-либо примеси (другого вида или штамма микроорганизмов, ДНК и проч.), изменяющей изучаемые или используемые свойства этой среды.

1.Контаминация при молекулярно-генетических исследованиях является причиной ложно-положительных результатов.

2.Причины: перенос через предметы и реагенты как самой ДНКматрицы (реже), так и ампликонов (очень часто), получаемых в больших количествах во многих пробирках в течение ежедневной работы.

Требования к организации работ

Исследование материала, содержащего (подозрительного на содержание) микроорганизмы III–IV групп патогенности, методами амплификации нуклеиновых кислот, связано с необходимостью одновременного обеспечения и соблюдения персоналом правил биологической безопасности и требований к организации и проведению данных работ с целью предотвращения контаминации нуклеиновыми кислотами и (или) ампликонами исследуемых проб помещений и оборудования.

Данные исследования проводят в организациях, имеющих лицензию на деятельность, связанную с возбудителями инфекционных заболеваний III–IV групп патогенности, в лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о возмож-

ности проведения данных работ, выданных в установленном порядке.

Противоэпидемический режим работы лаборатории должен быть обеспечен в соответствии СП 1.3.2322-08, регламентирующих работу с микроорганизмами III–IV групп патогенности.

Требования к помещениям и оборудованию лаборатории, выполняющей молекулярно-биологические диагностические исследования

При строительстве новых или реконструкции имеющихся помещений лабораторию размещают в отдельно стоящем здании (изолированной части здания, этажа) в соответствии с СП 1.3.1285-03 и (или) СП 1.3.2322-08.

При отсутствии возможности размещения помещений лаборатории в виде отдельного блока допускается проведение исследований поступающего материала на базе действующей микробиологической лаборатории при условии организации в ней самостоятельных или выделенных в составе других функциональных помещений рабочих зон, соответствующих этапам проведения анализа, поточности движения персонала и материалов.

Помещения лаборатории должны быть боксированными (боксы с предбоксами), соответствующим образом промаркированы (нумерация или название рабочих зон) и оборудованы при- точно-вытяжной вентиляцией, водопроводом, канализацией, электричеством и отоплением, средствами пожаротушения, естественным и искусственным освещением и быть непроницаемыми для грызунов и насекомых.

Внутреннюю отделку помещений осуществляют кафелем (пол, стены) или краской (стены, потолок), устойчивой к действию моющих и дезинфицирующих средств, поверхности стен, пола и потолка в лабораторных помещениях должны быть гладкими, без щелей, легко обрабатываемыми.

В помещениях рабочих зон должны быть установлены бактерицидные лампы. Расчет режима работы бактерицидных ламп проводят в соответствии с Руководством “Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в помещениях” Р 3.5.1904-04. – М.: 2005.

Окна должны быть плотно закрыты, возможно использование светозащитных пленок из материала, устойчивого к действию используемых дезинфицирующих средств. Использование жалюзи (из-за адсорбции ими пыли) запрещено.

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ