6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Что делать с больными, выделяющими НТМБ

–кто должен лечить таких больных?

–где должны лечиться такие больные?

–как и чем нужно лечить таких больных?

Пути решения: внедрение в практику бактериологических лабораторий современных методов молекулярно-генетической идентификации микобактерий, отвечающих всем требованиям к качеству анализа.

Лекарственная чувствительность НТМБ и методы ее определения

Нетуберкулезные микобактерии, несмотря на то, что принадлежат к роду Mycobacterium, в подавляющем числе случаев имеют природную устойчивость к большинству противотуберкулезных препаратов. Ошибочная диагностика может привести к постановке диагноза «туберкулез с широкой лекарственной устойчивостью».

По опыту зарубежных исследователей (Японии и США) для лечения микобактериозов, наряду с противотуберкулезными препаратами, применяются антибиотики широкого спектра действия: кларитромицин, тобрамицин, амоксициллин/клавулоновая кислота, импинем, тайгециклин, доксициклин и т.д. Поэтому необходимо для НТМБ проводить тест на определение ЛЧ не только к противотуберкулезным препаратам, но и к препаратам широкого спектра действия. Критических концентраций препаратов для НТМБ не разработано, поэтому для каждого препарата определяется минимальная ингибирующая концентрация (МИК).

На отечественном рынке продается тест-система планшетного формата для определения МИК для быстрорастущих и для медленнорастущих НТМБ Sensititre производства Trek Diagnostic Systems, Magellan Biosciences, UK.

В 96-луночном планшете на дне лунок лиофилизированы препараты в разных концентрациях. В лунки добавляется среда с исследуемой культурой НТМБ. Планшет инкубируется при 35°С в течение 3–7 дней для быстрорастущих видов НТМБ и от 7 до 14 дней для медленнорастущих. Результаты роста культуры на среде с различными концентрациями препаратов считываются или вручную под инвертированным микроскопом, или с использованием автоматического анализатора Sensititre Vizion System®.

Устойчивость к большинству ПТП микобактерий, выделенных у больных микобактериозом, существенно ограничивает терапевтические возможности, и речь может идти только об индивидуализированном лечении, основанном на определении лекарствен-

МОДУЛЬ 11. Молекулярно-генетические основы резистентности микобактерий

Тема 11.2. «Молекулярно* -генетические методы определения ЛУ МБТ»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план семинарского занятия

Вопросы, прорабатываемые на семинаре:

•Биочиповая технология

•ДНК-стриповая технология

•Аллель-специфическая ПЦР

•Секвенирование генов МБТ, ответственных за устойчивость к ПТП Цель семинара – формирование у слушателей современных

представлений о методах детекции мутаций в геноме микобактерий туберкулеза, ответственных за возникновение лекарственной чувствительности к противотуберкулезным препаратам первого и второго ряда.

Семинар проводится в интерактивной форме. При обсуждении учитывается самоподготовка по модулю 11. «Молекулярно-гене- тические основы резистентности микобактерий» темы 11.2 «Мо- лекулярно-генетические методы определения ЛУ МБТ»

Вводная часть (5–10 мин)

Ведущий семинара обсуждает со слушателями рабочий план и определяет ведущую тему дискуссии. Преподаватель дает понятия о фенотипической и генотипической устойчивости микобактерий. Кратко перечисляет традиционные методы микробиологической диагностики лекарственной чувствительности (ЛЧ), останавливается на их достоинствах и недостатках.

Основная часть (30 мин)

Ведущий семинара перечисляет современные требования, предъявляемые к тест-системам для определения ЛЧ, и поясняет, что молекулярно-генетические методы определения ЛЧ по альтерациям в геноме отвечают этим требованиям.

Преподаватель перечисляет достоинства и ограничения применения молекулярно-генетических методов определения ЛЧ.

Преподаватель перечисляет все методы выявления мутаций, ответственных за возникновения лекарственной устойчивости и

*Демонстрационный материал к семинару представлен на диске. Может быть распечатан в качестве раздаточного материала.

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

подробно останавливается на тех методах, которые к настоящему времени внедрены в практику противотуберкулезных учреждений.

Заключительная часть

В заключении преподаватель сравнивает традиционные микробиологические и молекулярно-генетические методы определения ЛЧ, подчеркивая, что решение проблемы определения спектра устойчивости M.tuberculosis должно быть комплексным.

Краткий информационный материал к семинару Модуля 11.

«Молекулярно-генетические основы резистентности микобактерий» Тема 11.2. «Молекулярно-генетические методы определения ЛУ МБТ».

Фенотипическая лекарственная устойчивость – устойчивость на уровне фенотипа, способность к росту культуры микобактерий на средах, содержащих противотуберкулезные препараты.

Генотипическая лекарственная устойчивость – устойчивость на уровне генотипа, изменения в геноме микобактерий (точечные мутации, делеции), приводящие к невозможности роста культуры микобактерий на средах с препаратами.

Традиционные бактериологические методы определения ЛЧ микобактерий туберкулеза

1. Посев на плотные среды, содержащие критические концентрации противотуберкулезных препаратов

•метод абсолютных концентраций

•ускоренный метод Грисса (модификация метода абсолютных концентраций)

•метод пропорций

Время выполнения анализа – 4 недели согласно Приказу МЗ РФ от 20.03.2003 г.№109. Вместе с получением культуры – до 2-х месяцев.

Препараты, с которыми можно выполнять тест – все противотуберкулезные препараты 1-го и 2-го ряда, кроме пиразинамида.

2. Посев на жидкие питательные среды, содержащие критические концентрации противотуберкулезных препаратов

•метод пропорций в автоматической системе детекции роста микобактерий BACTEC MGIT 960

Время выполнения анализа – 12 дней максимум, в среднем 7–9 дней. Вместе с получением культуры – до 1-го месяца.

Препараты, с которыми можно выполнять тест – противотуберкулезные препараты 1-го и 2-го ряда, к которым отработаны критические концентрации для BACTEC MGIT 960 (стрептомицин, изониазид, рифампицин, этамбутол, пиразинамид, этиона-

мид, протионамид, амикацин, капреомицин, офлоксацин, левофлоксацин, моксифлоксацин, спарфлоксацин, линезолид и др.).

•метод пропорций в автоматической системе детекции роста микобактерий VersaTrek (Magellan Bioscience)

Время выполнения анализа – 12 дней максимум, в среднем 7–9 дней. Вместе с получением культуры – до 1-го месяца.

Препараты, с которыми можно выполнять тест – изониазид, рифампицин, этамбутол и пиразинамид.

Недостатки всех микробиологических методов определения ЛЧ

– очень большое время получения анализа, большие трудозатраты, стоимость и высокий риск заражения персонала лаборатории при работе с чистой культурой.

Поскольку ранняя диагностика туберкулеза и быстрое выявление спектра лекарственной чувствительности микобактерий к ПТП лежит в основе назначения адекватной терапии, методы выявления ЛЧ микобактерий должны обладать следующими характеристиками:

1.Скорость выполнения анализа. Предпочтение отдается наиболее быстрым методам.

2.Воспроизводимость результатов.

3.Возможность поставить тест на ЛЧ со всеми противотуберкулезными препаратами, имеющимися в распоряжении врачейфтизиатров.

4.Снижение стоимости анализа.

5.Снижение трудозатрат.

6.Снижение риска заражения персонала при работе.

Молекулярно-генетические методы, внедренные в практику противотуберкулезных лабораторий

•Биочипы

•ПЦР в режиме реального времени

•ДНК-стриповая технология

•Секвенирование

Биочипы

Отечественная технология, производитель ООО «Биочип», Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. Аналогов за рубежом не имеет.

В настоящее время производится два набора: «ТБ-БИОЧИП» определяет мутации в генах, ответственных за

возникновение устойчивости к рифампицину и изониазиду (МЛУбиочип)

«ТБ-БИОЧИП-2» определяет мутации в генах, ответственных за возникновение устойчивости к фторхинолонам.

Этапы проведения анализа – одинаковые для двух наборов.

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

•Короткий олигонуклеотид с гасителем флюоресценции, комплементарный аллель-специфическим праймерам. Связывается с аллель-специфическими праймерами и гасит их флюоресценцию.

Если анализируемый образец не содержит мутаций, то будет идти ПЦР-РВ с прямым и обратным праймерами, не мечеными и не содержащими мутаций, и нарастание флюоресценции будет наблюдаться только по флюорофору гибридизационного зонда.

Если образец содержит мутацию, то нарастание флюоресценции будет наблюдаться и по флюорофору гибридизационного зонда, и по флюорофору 5’-флюоресцентно-меченного аллельспецифичного праймера, который будет встраиваться вместо обычного праймера, не содержащего мутаций.

Стриповая технология

На российском рынке технология представлена германской фирмой Hain lifescience (HAIN-тесты). Фирма выпускает наборы на определение мутаций, ответственных за возникновение устойчивости к R,H (GenoType® MTBDRplus), а также этамбутолу, фторхинолонам, инъекционным препаратам (виомицин, канамицин, капреомицин, амикацин) (GenoType® MTBDRsl)

В основе метода лежит ПЦР с биотинилированными праймерами, ограничивающими участки генов, в которых возможно возникновение искомых мутаций. После получения ампликонов проводят множественную обратную гибридизацию на стриповых мембранах-полосках, на которых иммобилизованы искусственно синтезированные нуклеотиды, содержащие или не содержащие мутации. В зависимости от того, содержит ли выделенная ДНК мутации или нет, ампликоны будут гибридизоваться с олигонуклеотидами с мутациями или без. После гибридизации следуют процедуры отмывки от несвязавшихся продуктов и проявление гибридизационных полос. Результат считывается вручную или автоматически в специальном анализаторе.

Секвенирование генома

Внастоящее время этот метод используется в научных целях и не внедрен в практику противотуберкулезных ПЦР-лабораторий. Секвенирование – это «золотой стандарт» поиска альтераций в геноме организмов, который заключается в расшифровке последовательности нуклеотидов, составляющих ДНК.

Впоследние 5 лет происходит настоящий бум в развитии этой технологии – появляются «настольные» приборы для полногеномного секвенирования, позволяющие за 1 рабочий день расшифровать весь геном организма. Однако расходные реагенты для такого анализа слишком дороги. При условии снижения стоимости ана-

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

лиза секвенирование сможет стать незаменимым инструментом не только в научных исследованиях (поиск новых механизмов формирования лекарственной устойчивости), но и в клинической лабораторной практике.

Заключительная часть

В заключительной части семинара преподаватель останавливается на сравнении разных методов определения ЛЧ микобактерий туберкулеза (табл. 1).

Рекомендуемая литература

1.Антонова О.В., Грядунов С.А., Лапа С.А., Кузьмин А.В., Ларионова Е.Е., Смирнова Т.Г., Носова Е.Ю., Скотникова О.И., Черноусова Л.Н., Мороз А.М., Заседателев А.С., Михайлович В.М. Выявление мутаций в геноме M.tuberculosis приводящих к устойчивости к фторхинолонам методом гибридизации на биологических микрочипах // БЭБИМ. – 2008. – Том 145. – № 1. – С. 115–120.

2.Владимирский М.А., Аляпкина Ю.С., Варламов Д.А., Алексеев Я.И. Применение метода ПЦР в реальном времени для определения и контроля за распространением лекарственно-устойчи- вых штаммов микобактерий туберкулеза // Проблемы туберкулеза и болезни легких. – 2008. – №4. – С. 38–44.

3.Mikhailovich V., Lapa S., Gryadunov D., Sobolev A., Strizhkov B., Chernyh N., Skotnikova O., Irtuganova O., Moroz A., Litvinov V., Vladimirskii M., Perelman M., Chernousova L., Erokhin V., Zasedatelev A., Mirzabekov A. Identification of rfampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by hybridization, PCR, and ligase detection reaction on oligonucleotide microchips // J. Clin. Microbiol.

– 2001. – Vol. 39. – P. 2531–2540.

4.Vasylieva I.,Samoilova A., Larionova E., Chernousova L. Impact of rapid diagnostics of M.tuberculosis drug resistance by GenoType MTBDRplus GenoType MTBDRsl (Hain Lifescience GmbH, Germany) on efficacy of treatment of MDR/XDR TB patients // Am. J. Respir. Crit. Care Med. – 2012. – Vol. 185. – A3313.

Материально-техническое обеспечение

Демонстрационные / раздаточные материалы, мультимедийная или проекционная демонстрационные системы, экран, лазерная указка.

Тема 11.3. «Спектр мутаций в геноме МЛУ и ШЛУ штаммов»*

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план семинарского занятия

Вопросы, прорабатываемые на семинаре:

•Мутации в геноме МБТ с МЛУ и ШЛУ, выделенных от впервые выявленных больных

•Мутации в геноме МБТ с МЛУ и ШЛУ, выделенных от больных с неудачей лечения и рецидивами

Цель семинара – формирование у слушателей представлений о спектре мутаций в основных генах, ответственных за устойчивость к рифампицину, изониазиду и фторхинолонам

Семинар проводится в интерактивной форме. При обсуждении учитывается самоподготовка по модулю 11 «Молекулярно-генети- ческие основы резистентности микобактерий» темы 11.1 «Гены микобактерий, ответственные за устойчивость к ПТП».

Вводная часть (5–10 мин)

Ведущий фиксирует внимание слушателей, что изучение спектра мутаций в генах, ответственных за возникновение ЛУ к ПТП, особенно к препаратам 1-го ряда – рифампицину и изониазиду, необходимо для понимания механизмов развития множественной лекарственной устойчивости к ПТП в процессе лечения

Основная часть (30 мин)

Ведущий демонстрирует слушателям слайды с данными о спектре мутаций в геноме микобактерий, характерных для впервые выявленных больных и ранее леченых больных с неудачами лечения или рецидивами.

Заключительная часть

Преподаватель отвечает на вопросы слушателей по теме семинара

Краткий информационный материал по модулю 11

«Молекулярно-генетические основы резистентности микобактерий» Тема 11.3. «Спектр мутаций в геноме МЛУ и ШЛУ штаммов»

У микобактерий, выделенных от впервые выявленных больных, мутации в генах, ответственных за возникновение лекарст-

*Демонстрационный материал к семинару представлен на диске. Может быть распечатан в качестве раздаточного материала.

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ