6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

МОДУЛЬ 10. Молекулярно-генетическая идентификация микобактерий

Тема 10.4. «Методы,* применяемые для видовой идентификации НТМБ»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план семинарского занятия

Вопросы, прорабатываемые на семинаре:

•методы идентификации микобактерий до вида;

•этапы проведения ПЦР-анализа с последующей гибридизацией продуктов амплификации на стрипах;

•принцип использования метода масс-спектрометрии для идентификации микобактерий до вида;

•идентификацию микобактериальных культур до вида – алгоритм применения в практике противотуберкулезной лаборато-

рии Цель семинара – формирование у слушателей представлений о

современных методах идентификации микобактерий до вида и алгоритме их применения в практике противотуберкулезной лаборатории.

Семинар проводится в интерактивной форме. При обсуждении темы семинара ведущий и слушатели используют материалы лекций по теме модуля 10. «Молекулярно-генетическая идентификация микобактерий» темы 10.1 «Основные мишени и методы, позволяющие дифференцировать МБТК от НТМБ», а также учитывается самоподготовка по модулю 10. «Молекулярно-гене- тическая идентификация микобактерий». «Методы, позволяющие дифференцировать виды микобактерий внутри туберкулезного комплекса», «Молекулярные мишени, позволяющие проводить видовую дифференциацию НТМБ», «Методы, применяемые для видовой идентификации НТМБ».

Вводная часть (5–10 мин)

Ведущий семинара обсуждает со слушателями рабочий план и определяет ведущую тему дискуссии. Ведущий перечисляет основные методы идентификации микобактерий до вида – микробиологические и молекулярно-генетические. Преподаватель подчеркивает, что, если для выявления возбудителей туберкулеза и микобактериозов в диагностическом материале необходимо использовать комплексный подход с применением и микробиологи-

*Демонстрационный материал к семинару представлен на диске. Может быть распечатан в качестве раздаточного материала.

ческих, и молекулярно-генетических методов, то для идентификации микобактерий до вида именно молекулярно-генетические методы, основанные на ПЦР, занимают ведущую роль, так как традиционные микробиологические методы имеют ряд существенных недостатков (длительность проведения анализа, вариабельность в интерпретации результатов)

Основная часть (30 мин)

Восновной части семинара преподаватель подробно останавливается на молекулярно-генетических методах идентификации возбудителей туберкулеза и микобактериозов и перечисляет их достоинства

Вкачестве примера преподаватель разбирает методику проведения идентификации микобактерий до вида с помощью стриповой технологии (проведение ПЦР с праймерами, комплементарными участкам, кодирующим 16S-23S рибосомальную РНК, с последующей гибридизацией продуктов амплификации на стрипах с иммобилизованными олигонуклеотидами). Преподаватель фиксирует внимание слушателей на достоинствах и ограничениях этого метода.

Далее преподаватель разбирает методику проведения идентификация микобактерий до вида с использованием ПЦР в режиме реального времени, сравнивая ее со стриповой технологией.

Во второй части семинара преподаватель переходит к идентификации микобактерий до вида с использованием метода массспектрометрии и дает краткое определение метода. Затем ведущий объясняет суть метода масс-спектрометрии и принцип идентификации микобактерий до вида с его использованием.

Заключительная часть

В заключении преподаватель подчеркивает, что врач-фтизиатр, равно как и врач клинико-диагностической лаборатории должен быть в курсе всех новейших разработок в области выявления и идентификации возбудителей туберкулеза и микобактериозов.

Краткий информационный материал к семинару модуля 10.

Молекулярно-генетическая идентификация микобактерий. Тема 10.4. «Методы, применяемые для видовой идентификации НТМБ».

Достоинства молекулярно-генетических методов идентификации микобактерий:

1.Высокая специфичность методов

2.Быстрота получения результатов

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

Идентификация микобактерий до вида с использованием метода масс-спектрометрии.

Краткое определение метода:

•Масс-спектрометрия – метод определения химического, фазового состава и молекулярной структуры вещества, основанный на регистрации спектра масс ионов, образованных в результате ионизации атомов и (или) молекул пробы.

•Масс-спектрометрия – представляет собой современную фундаментальную и прикладную физико-химическую науку. В её задачу входит получение и накопление знаний о составе веществ, их структуре, физико-химических свойствах, а также происходящих с ним процессах.

•Масс-спектрометр – прибор для разделения ионизованных частиц (атомов, молекул, кластерных образований) по их массам (точнее, по отношению массы иона m его заряду e путем воздействия магнитных и электрических полей, а также для определения их масс и относительных содержаний, т.е. спектра масс).

Принцип метода масс-спектрометрии

Чтобы получить масс-спектр, необходимо:

1.Нейтральные молекулы анализируемого вещества превратить в заряженные ионы.

Способ ионизации исследуемого вещества зависит от физикохимических свойств самого вещества (табл. 2):

Табл. 2

Способ ионизации исследуемого вещества в зависимости от физико-химических свойств

Для работы с биологическими объектами используется мат- рично-активированная лазерная десорбция/ионизация (MALDI)

Матрично-активированная ионизация – мягкий метод ионизации (поэтому он подходит для биологических объектов), когда анализируемый образец наносится на подложку вместе с матрицей.

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Матрица – специальное вещество, принимающее на себя удар лазера, поглощающее энергию лазера и передающее ее в виде заряда на молекулы исследуемого вещества.

Примеры матриц:

–производные коричной кислоты

–производные бензойной кислоты

–производные синапиновой кислоты

–производные серуловой кислоты

2. Отсортировать получившиеся ионы по массе и заряду. Прибор, проводящий масс-спектрометрию с MALDI–время-

пролетный масс-спектрометр (рис. 9).

Ионы исследуемого вещества попадают в вакуумную часть прибора, где под воздействием электрического поля движутся со скоростью, зависящей от величины их заряда и массы.

Основным условием точной работы прибора является создание глубокого вакуума. Это обеспечивает отсутствие на пути летящих ионов посторонних молекул и атомов, столкновения с которыми приводит к рассеиванию и превращению заряженных ионов обратно в нейтральные частицы.

3. Детектировать ионизированные молекулы и атомы вещества. Для детекции ионов используются динодные вторично-элек- тронные умножители. Прибор измеряет время пролета заряженный ионов исследуемого вещества и строит спектр масс (рис. 10).

Принцип идентификации бактерий с использованием MALDI масс-спектрометрии

В основе видовой идентификации бактерий лежит получение масс-спектров рибосомальных белков. Известно, что аминокислотный состав рибосомальных белков прокариот стабилен в пределах одного вида и различен у разных видов.

Сравнение профилей рибосомальных белков Mycobacterium позволит быстро и точно определять их видовую принадлежность (рис. 11–13).

Достоинства метода

1.Точность проведения анализа

2.Быстрота проведения анализа – до 384 образца за рабочий день

3.Дешевизна. Стоимость реагентов и расходных материалов на 1 анализ не превышает 100 рублей.

4.Компьютерная интерпретация результатов. Возможность построения «дерева родства»

5.Возможность автоматизации процесса.

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Тема 10.5. «Значение молекулярно-генетической идентификации* микобактерий для фтизиатрической клиники»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план семинарского занятия

Вопросы, прорабатываемые на семинаре:

•лекарственная чувствительность НТМБ;

•НТМБ как «маска» ШЛУ ТБ;

•значение молекулярно-генетической идентификации НТМБ для исключения ошибок диагностики (дифференциация туберкулез/микобактериоз);

•частота выявления НТМБ в клинике с использованием моле- кулярно-генетических методов; Цель семинара – формирование у слушателей представлений о

возможных ошибках в диагностике туберкулеза, связанной с недостаточными знаниями о природе и методах идентификации НТМБ

Семинар проводится в интерактивной форме. При обсуждении темы семинара ведущий и слушатели используют материалы лекций модуля 10. «Молекулярно-генетическая идентификация микобактерий» по теме 10.5 «Значение молекулярно-генетической идентификации микобактерий для фтизиатрической клиники», а также учитывается самоподготовка по теме 10.4 «Методы, применяемые для видовой идентификации НТМБ».

Вводная часть (5–10 мин)

Ведущий семинара обсуждает со слушателями рабочий план и определяет ведущую тему дискуссии. Ведущий перечисляет основные проблемы диагностики микобактериозов в России и пути решения этих проблем.

Основная часть (30 мин)

В основной части семинара преподаватель объясняет, как важно дифференцировать туберкулез от микобактериоза. Преподаватель объясняет, в чем трудности дифференциальной диагностики туберкулеза и микобактериоза. Ведущий фиксирует внимание слушателей на возможных лабораторных ошибках в выявлении НТМБ (схема 1), когда, без адекватно выполненной идентификации врачам может быть выдан неправильный результат. Далее ведущий останавливается на лекарственной чувстви-

*Демонстрационный материал к семинару представлен на диске. Может быть распечатан в качестве раздаточного материала.

тельности НТМБ и методах ее определения. Преподаватель фиксирует внимание слушателей на природной устойчивости НТМБ ко многим противотуберкулезным препаратам, микобактериоз может «маскировать» туберкулез с широкой лекарственной устойчивостью.

Говоря о частоте выявления НТМБ в лабораториях, преподаватель отмечает недостаточность информации.

Преподаватель подчеркивает, что однократное выявление НТМБ в пробирке не может являться однозначным критерием заболевания и предлагает слушателям стандарты для постановки диагноза микобактериоз (табл. 1). Преподаватель приводит пример частоты выявления НТМБ (табл. 2–4).

Заключительная часть

В заключении преподаватель подчеркивает, что только грамотно проведенная идентификация позволит избежать неправильного диагноза и неадекватного лечения больных микобактериозами.

Краткий информационный материал к семинару модуля 10

Молекулярно-генетическая идентификация микобактерий. Тема 10.4. «Методы, применяемые для видовой идентификации НТМБ».

Проблемы диагностики микобактериоза в России

Идентификация культур микобактерий до вида почти не проводится в отечественных баклабораториях с большим потоком анализов. Грамотная идентификация проводится только в крупных исследовательских центрах.

Практически не производится отечественных молекулярно-ге- нетических тест-систем (например, ПЦР) для быстрой и дешевой идентификации кислотоустойчивых палочек, а зарубежные аналоги дороги.

Проблема микобактериозов слабо освещена в специальной литературе, статистических данных по заболеваемости найти очень трудно.

По клиническим проявлениям туберкулез и микобактериозы очень схожи. Только грамотно проведенная идентификация с помощью молекулярно-генетических методов поможет врачам установить правильный диагноз.

Ошибки в лабораторной диагностике микобактериозов приводят к неправильной постановке диагноза и назначению неадекватной схемы химиотерапии.

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ