6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

Тема 9.4. «Разнообразие* тест-систем для детекции результатов ПЦР-анализа»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план семинарского занятия

Вопросы, прорабатываемые на семинаре:

•Тест-системы с электрофоретическим анализом результатов

•Тест-системы для проведения ПЦР в режиме реального времени

•Особенности основных тест-систем для ПЦР-диагностики туберкулеза Цель семинара – формирование у слушателей современных

представлений о способах визуализации результатов ПЦР, интерпретации данных и основных тест-системах, представленных на отечественном рынке.

Семинар проводится в интерактивной форме. При обсуждении темы семинара учитывается самоподготовка по модулю 9 «Моле- кулярно-генетические методы для выявления микобактерий туберкулезного комплекса и НТМБ» темы 9.2. «ПЦР-основа для мо- лекулярно-генетических исследований во фтизиатрии» и темы 9.3. «Методология проведения ПЦР-анализа»

Вводная часть (5–10 мин)

Ведущий семинара обсуждает со слушателями рабочий план и определяет ведущую тему дискуссии.

Основная часть (30 мин)

Преподаватель рассказывает слушателям о способах визуализации результатов ПЦР, которые делятся на способы получения результатов по конечной точке (электрофорез, измерение флюоресцентного сигнала на последних циклах амплификации) и получение результатов непосредственно во время прохождения реакции, т.е. в режиме реального времени. Преподаватель подробно останавливается на методе электрофореза, объясняя его принцип. Рассказывая о получении результата ПЦР путем измерения флюоресцентного сигнала на последних циклах амплификации, преподавателю следует подчеркнуть, что этот способ являлся переходным этапом от электрофоретической визуализации к ПЦР в режиме реального времени. Как и в случае электрофореза, результат можно было получить только качественный (да или нет). Практически во всех современных тест-системах сейчас используется

*Демонстрационный материал к семинару представлен на диске. Может быть распечатан в качестве раздаточного материала.

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ПЦР в режиме реального времени. Преподаватель подчеркивает преимущества получения результатов в режиме реального времени по сравнению с методом разделения заряженных молекул ДНК в электрофорезе (повышение специфичности анализа, сокращение времени исследования, снижение вероятности контаминации, удешевление (нет необходимости в выделении специального помещения для электрофореза, покупки реагентов и электрофоретического оборудования), возможность проведения количественной оценки). Преподаватель рассказывает о разнообразных способах получения результатов в тест-системах, использующих ПЦР в режиме реального времени (использование прямых коротких зондов (Taqman) с прикрепленными к ним флюорофором и гасителем флюоресценции, использование зондов-биконов (зондов-маяков), использование интеркалирующих красителей (например, SybrGreen, EvaGreen) для построения кривых плавления.

Говоря об особенностях тест-систем для ПЦР-диагностики туберкулеза, преподаватель подчеркивает, что на отечественном рынке сейчас имеется продукция нескольких отечественных и зарубежных фирм. При выборе тест-системы пользователю необходимо руководствоваться следующими критериями:

1.Тест-системы должны быть дешевыми (в этом пункте отечественные производители имеют приоритет перед зарубежными).

2.Тест-системы для детекции возбудителя туберкулеза в диагностическом материале должны быть в режиме реального времени.

3.Трудозатраты при использовании тест-системы должны быть минимальны. Предпочтение желательно отдать полностью собранным тест-системам.

Заключительная часть

В заключении преподаватель подчеркивает необходимость понимания ПЦР для правильного применения ее в генодиагностике инфекционных заболеваний

Краткий информационный материал к семинару модуля 9.

«Молекулярно-генетические методы для выявления микобактерий туберкулезного комплекса и НТМБ» тема 9.4. «Разнообразие тест-систем для детекции результатов ПЦР-анализа»

Электрофорез в агарозном геле

Детекция методом электрофореза в агарозном геле (только по конечной точке): разделение заряженных молекул (ДНК) в пори-

стом геле в зависимости от их размера под действием электрического поля (рис. 1)

•ДНК (ампликон) имеет отрицательный заряд – в электрическом поле движется от «-» к «+»

•Молекулы ДНК разного размера имеют различную подвижность в агарозном геле

Размер ампликона можно оценить, сравнив его пробег с пробегом молекул ДНК известной длины

Электрофорез в агарозном геле (рис. 2)

Преимущества:

1.Не требуется сложного оборудования

2.Низкая стоимость реактивов

Недостатки:

1.Высокий риск контаминации (загрязнения продуктами пре-

дыдущих ПЦР)

2.Требуется дополнительное помещение и персонал для стадии детекции продукта

3.Трудоемкость

4.Только качественный анализ (есть/нет)

Флюоресцентный метод детекции (рис. 3)

Флюоресцентный метод детекции по конечной точке (FLASH): пробирки с продуктами ПЦР анализируются специальным флюоресцентным детектором (рис. 4).

Преимущества:

1.Низкая стоимость оборудования для детекции

2.Низкая трудоемкость

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

3.Не требуется дополнительного помещения и персонала

4.Снижение риска контаминации

5.Автоматическая регистрация и интерпретация данных

Недостатки:

1.Только качественный анализ (есть/нет)

2.Более дорогие реактивы (по сравнению с форезом)

Что такое ПЦР в реальном времени (real-time PCR)?

Флюоресцентный метод детекции в режиме реального времени (real-time PCR):

•Определение выхода продукта после каждого цикла амплификации

•Построение по этим данным кинетической кривой ПЦР

•Определение относительной концентрации субстрата на основании анализа этой кривой Стадия детекции совмещена со стадией амплификации.

Кинетические кривые ПЦР в реальном времени (рис. 5) Кинетическая кривая ПЦР в координатах "Уровень флюорес-

ценции – цикл амплификации" имеет сигмоидную форму. В ней можно выделить три стадии:

Стадию инициации (когда ПЦР-продукты еще не детектируются флюоресцентной меткой);

Экспоненциальную стадию (в которой наблюдается экспоненциальная зависимость количества флюоресценции от цикла ПЦР);

Плато (стадию насыщения).

Пороговый цикл (threshold cycle, C(T)) такой цикл n, на котором достигается некий заданный уровень флюоресценции – пороговая флюоресценция (рис. 6).

Значение С(T) прямо пропорционально логарифму количества субстрата.

ПЦР-РВ позволяет сравнивать количества субстрата при условии, что эффективность реакции и заданный уровень пороговой флюоресценции одинаковы для каждой из сравниваемых реакций.

Сравнение ПЦР и ПЦР – РВ (см. табл., демонстрационные материалы)

Флюоресцентные зонды делятся на две категории:

•использующие неструктурированные линейные зонды (TaqManTM, LightCycler, Lanthanide, EclipseTM);

•использующие структурные зонды (Molecular Beacons, ScorpionsTM, CycliconsTM).

Преимущества и недостатки систем ПЦР-РВ со специфической детекцией Преимущества систем, использующих флюоресцентные олиго-

нуклеотидные зонды:

•специфичность не ограничивается специфичностью праймеров, дополнительная специфичность за счет комплементарного зонда;

•возможность проведения мультиплексной ПЦР (до 4-х красителей);

•огромный выбор вариантов ПЦР-РВ.

•измерение исходного количества специфической ДНК (РНК) в исследуемом образце;

•широкий динамический диапазон от единичных до 109 копий;

•возможность сравнительного количественного анализа для нескольких различных ДНК-мишеней в одной пробирке одновременно;

•обнаружение и определение процентного содержания ДНК с измененной последовательностью;

•исключение послеамплификационных манипуляций с продуктом, и, как следствие, существенное снижение риска контаминации, сокращение времени анализа, упрощение организации ПЦР лаборатории;

•автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов.

Что необходимо для работы по технологии ПЦР в реальном

времени:

•прибор для ПЦР-РВ;

•программное обеспечение;

•реактивы – наборы, тест-системы, праймеры и зонды;

•вспомогательное оборудование – центрифуги, вортексы, ламинар;

•расходные материалы – пробирки, стрипы, плашки.

Рекомендуемая литература

1.Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. – Изд. Мир, 1984 г. – 479 с.

2.Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и соавт. ПЦР «в реальном времени». Под ред. Д.В. Ребрикова, – изд 2-е, испр. и доп. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. – 2009. – 223 с.

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Во второй части семинара преподаватель напоминает слушателям об основных задачах, стоящих перед противотуберкулезной лабораторией:

–быстро выявить возбудителя туберкулеза

–провести точную идентификацию

–в кратчайшие сроки установить лекарственную чувствительность МБТ к противотуберкулезным препаратам.

Руководствуясь этими задачами, преподаватель определяет место ПЦР-анализа как одного из основных методов, используемых в диагностике туберкулеза. Преподаватель предлагает слушателям схему-алгоритм проведения исследования диагностического материала в противотуберкулезной лаборатории и поясняет, что использование ПЦР позволит врачам-фтизиатрам получить результат о выявлении возбудителя и лекарственно чувствительности

косновным противотуберкулезным препаратам первого и второго ряда в течение максимум 3-х дней от момента поступления больного в стационар.

Заключительная часть

В заключении преподаватель подчеркивает, что на сегодняшний момент нет метода диагностики туберкулеза, который бы мог заменить все остальные. Только правильная комбинация микробиологических и молекулярно-генетических подходов позволит врачу-фтизиатру быстро и точно установить диагноз туберкулез и назначить адекватную химиотерапию.

Краткий информационный материал к семинару модуля 9.

«Молекулярно-генетические методы для выявления микобактерий туберкулезного комплекса и НТМБ». тема 9.5. «Эффективность использования ПЦР для диагностики туберкулеза в клинике»

Сравнение чувствительности традиционных методов выявления МБТ в диагностическом материале и ПЦР в режиме реального времени (данные отдела микробиологии ФГБУ "ЦНИИ туберкулеза" РАМН)

Табл. 1.

Результаты выявления микобактерий туберкулеза разными методами у пациентов, находящихся на лечении в ФГУБ "ЦНИИ туберкулеза" РАМН (2011 )