6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_
.pdf
Number Tandem Repeat Typing of Mycobacterium tuberculosis// J. Clin. Microbiol. – 2006. – Vol. 44. – P. 4498–4510.
11.Supply P., Mazars E., Lesjean S., Vincent V., Gicquel B., Locht C. Variable human minisatellite–like regions in the Mycobacterium tuberculosis genome // Mol. Microbiol. – 2000. – Vol. 36. – P. 762– 771.
12.van Embden J.D., Cave M.D., Crawford J.T., Dale J.W., Eisenach K.D., Gicquel B., Hermans P., Martin C., McAdam R., Shinnick T.M. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: recommendations for a standardized methodology // J. Clin. Microbiol. – 1993. – Vol. 31(2). – P. 406–409.
13.van Embden J.D.A, van Gorkom T., Kremer K., Jansen R., van Der Zeijst B.A., Schouls L.M. Genetic variation and evolutionary origin of the direct repeat locus of Mycobacterium tuberculosis complex bacteria // J. Bacteriol. – 2000. – Vol. 182. – P. 2393–2401.
14.van Soolingen D., Hermans P.W., de Haas P.E., Soll D.R., van Embden J.D. Occurrence and stability of insertion sequences in Mycobacterium tuberculosis complex strains: evaluation of an insertion sequence–dependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis // J. Clin. Microbiol. – 1991. – Vol. 29. – P. 2578–2586.
15.Yeh R.W., Ponce de Leon A., Agasino C.B., Hahn J.A., Daley C.L., Hopewell P.C., Small P.M. Stability of Mycobacterium tuberculosis DNA genotypes // J. Infect. Dis. – 1998. – Vol. 177. – P. 1107–1111.
Материально-техническое обеспечение
Демонстрационные / раздаточные материалы, мультимедийная или проекционная демонстрационные системы, экран, лазерная указка.
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
368
МОДУЛЬ 9. Молекулярно-генетические методы для выявления микобактерий туберкулезного комплекса и НТМ
Тема 9.2. «ПЦР – основа для молекулярно* -генетических исследований во фтизиатрии»
Количество аудиторных часов – 1
Примерный план семинарского занятия
Вопросы, прорабатываемые на семинаре:
•Этапы ПЦР (денатурация, отжиг праймеров, элонгация)
•Принцип ПЦР в реальном времени
•Преимущества ПЦР в диагностике туберкулеза
Цель семинара – формирование у слушателей современные представления об основном методе молекулярной биологии – ПЦР, его назначении и применении во фтизиатрии
Вводная часть (5–10 мин)
Ведущий семинара обсуждает со слушателями рабочий план и определяет ведущую тему дискуссии. Рекомендуется также напомнить слушателям о роли ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний, вернувшись материалам модуля 9. Темы 9.1. «Основные мишени в геноме микобактерий, лежащие в основе молекулярной диагностики».
Основная часть (30 мин)
Преподаватель объясняет слушателям принцип полимеразной цепной реакции, знакомит с «участниками» реакции и подробно останавливается на роли каждого. В деталях рассказывает, что происходит на каждой стадии классической ПЦР. Напоминает, что визуализация результатов ПЦР может быть осуществлена разными методами. Кратко останавливается на методе электрофореза, подчеркнув, что это метод относится к категории методов получения результатов по конечной точке. Затем переходит к объяснению принципа ПЦР в режиме реального времени, объясняет преимущества этого вида ПЦР перед классической и подробно описывает принцип и стадии реакции. Дает понятие о флюорофорах и их роли в реакции. Представляет слушателям, как выглядит результат ПЦР в режиме реального времени и рассказывает, как его интерпретировать. В последней части семинара преподаватель рассказывает о преимуществах ПЦР в диагностике туберкулеза, исполь-
*Демонстрационный материал к семинару представлен на диске. Может быть распечатан в качестве раздаточного материала.
Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ
369
|
зуя материалы лекции по теме 9.5. "Эффективность использования |
||
|
|||
|
ПЦР для диагностики туберкулеза в клинике". |
||
|
Заключительная часть |
||
|
В заключении преподаватель подчеркивает необходимость по- |
||
|
нимания ПЦР для правильного применения ее в генодиагностике |
||
|
инфекционных заболеваний |
||
|
Краткий информационный материал к семинару модуля 9. |
||
|
«Молекулярно-генетические методы для выявления |
||
|
микобактерий туберкулезного комплекса и НТМБ» тема 9.2. |
||
|
«ПЦР – основа для молекулярно-генетических исследований во |
||
|
фтизиатрии» |
||
|
Принцип метода полимеразной цепной реакции |
||
|
Принцип метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Роly- |
||
|
merase chain reaction) (PCR) был разработан Кэри Мюллисом |
||
|
(фирма "Cetis", США) в 1983. и в настоящее время широко исполь- |
||
|
зуется как для научных исследовании, так и для диагностики в |
||
|
практическом здравоохранении и службе госсанэпиднадзора (ге- |
||
|
нотипирование, диагностика инфекционных заболеваний). |
||
|
В основе метода ПЦР лежит комплементарное достраивание |
||
|
ДНК матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента ДНК- |
||
|
полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК. Есте- |
||
|
ственная репликация ДНК включает в себя несколько стадий: |
||
|
1) Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, расхож- |
||
|
дение нитей ДНК); |
||
|
2) Образование коротких двухцепочечных участков ДНК (за- |
||
|
травок, необходимых для инициации синтеза ДНК); |
||
|
3) Синтез новой цепи ДНК (комплементарное достраивание |
||
|
обеих нитей) |
||
|
Открытие термостабильной ДНК-полимеразы (Tаg-полиме- |
||
РЕКОМЕНДАЦИИ |
разы) из термофильных бактерий Тhermis aguaticus, оптимум ра- |
||
боты которой находится в области 70–72°С, позволило сделать |
|||
|
|||
|
процесс репликации ДНК циклическим. При многократном по- |
||
|
вторении циклов синтеза происходит экспоненциальное увеличе- |
||
|
ние числа копий специфического фрагмента ДНК, что позволяет |
||
|
из небольшого количества анализируемого материала, который |
||
МЕТОДИЧЕСКИЕ |
может содержать единичные клетки микроорганизмов получить |
||
достаточное количество ДНК копий для идентификации их мето- |
|||
|
|||
|
дом электрофореза. |
||
|
Комплементарное достраивание цепи начинается не в любой |
||
|
точке последовательности ДНК, а только в определенных старто- |
||
|
|
|
|
370
вых блоках – коротких двунитевых участках. При присоединении |
|
||
|
|||
таких блоков к специфическим участкам ДНК можно направить |
|
||
процесс синтеза новой цепи только в этом участке, а не по всей |
|
||
длине ДНК цепи. Для создания стартовых блоков в заданных |
|
||
участках ДНК используют две олигонуклеотидные затравки (20 |
|
||
нуклеотидных пар) называемые праймерами. Праймеры компле- |
|
||
ментарны последовательностям ДНК на левой и правой границах |
|
||
специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что |
|
||
достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. |
|
||
Таким образом, метод ПЦР представляет собой многократное уве- |
|
||
личение числа копий (амплификация) специфического участка |
|
||
ДНК, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. |
|
||
Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающих |
|
||
в различных температурных режимах (см. рис. 1). |
|
||
1 этап: Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали). Про- |
|
||
текает при 93–95° в течение 30–40 сек. |
|
||
2 этап: Присоединение праймеров (отжиг). Присоединение прай- |
|
||
меров происходит комплементарно к соответствующим последо- |
|
||
вательностям на противоположных цепях ДНК на границах спе- |
|
||
цифического участка. Для каждой пары праймеров существует |
|
||
своя температура отжига, значения которой располагаются в ин- |
|
||
тервале 50–65°С. Время отжига – 20–60 сек. |
|
||
3 этап: Достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраива- |
|
||
ние цепей ДНК происходит от 5'-конца к 3'-концу цепи в проти- |
|
||
воположных направлениях, начиная с участков присоединения |
СЕМИНАРАМ |
||
праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат до- |
|||
|
|||
бавляемые в раствор дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (дНТФ). |
|
||
Процесс синтеза катализируется ферментом термостабильной |
|
||
ДНК-полимеразой (Таg-полимеразой) и проходит при температуре |
К |
||
70–72°С. Время протекания синтеза – 20–40 сек. Образовавшиеся |
|||
МАТЕРИАЛЫ |
|||
в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матри- |
|||
|
|||
цами для второго цикла амплификации, в котором происходит об- |
|
||
разование искомого специфического фрагмента ДНК (ампли- |
|
||
кона). (см.рис.2). В последующих циклах амплификации |
МЕТОДИЧЕСКИЕ |
||
ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким об- |
|||
|
|||
разом происходит накопление ампликонов в растворе по формуле |
|
||
2n, где n – число циклов амплификации. Поэтому, даже если в ис- |
|
||
ходном растворе первоначально находилась только одна двухце- |
|
||
почечная молекула ДНК, то за 30–40 циклов в растворе накапли- |
2. |
||
вается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно |
|||
Раздел |
|||
для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом |
|||
|
|||
|
|
|
|
371
электрофореза в агарозном геле. Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате (амплификаторе), который по заданной программе автоматически осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации.
Кинетические кривые ПЦР в реальном времени Кинетическая кривая ПЦР в координатах "Уровень флюорес-
ценции – цикл амплификации" имеет сигмоидную форму (рис. 3).
Вней можно выделить три стадии:
•Стадию инициации (когда ПЦР-продукты еще не детектируются флюоресцентной меткой);
•Экспоненциальную стадию (в которой наблюдается экспоненциальная зависимость количества флюоресценции от цикла ПЦР);
•Плато (стадию насыщения).
|
Пороговый цикл (threshold cycle, C(T)) такой цикл n, на котором |
|
|
достигается некий заданный уровень флюоресценции – пороговая |
|
|
флюоресценция (рис. 4). |
|
|
Значение С(T) прямо пропорционально логарифму количества |
|
|
субстрата. |
|
|
ПЦР-РВ позволяет сравнивать количества субстрата при усло- |
|
|
вии, что эффективность реакции и заданный уровень пороговой |
|
|
флюоресценции одинаковы для каждой из сравниваемых реакций. |
|
|
Сравнение ПЦР и ПЦР – РВ (табл. 1, демонстрационный ма- |
|
|
териал) |
|
|
Преимущества метода ПЦР как метода диагностики |
|
|
инфекционных заболеваний: |
|
|
1. Прямое определение наличия возбудителей. Многие тради- |
|
|
ционные методы диагностики, например иммуноферментный ана- |
|
РЕКОМЕНДАЦИИ |
лиз, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизне- |
|
2. Высокая специфичность. Высокая специфичность метода |
||
|
деятельности инфекционных агентов, что дает лишь |
|
|
опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление |
|
|
специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает пря- |
|
МЕТОДИЧЕСКИЕ |
мое указание на присутствие возбудителя инфекции. |
|
ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется |
||
|
||
|
уникальный, характерный только для данного возбудителя фраг- |
|
|
мент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последователь- |
|
|
ностью праймеров, что исключает возможность получения ложных |
|
|
результатов, в отличие от метода иммуноферментного анализа, где |
372
нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антиге- |
|
||
|
|||
нами. |
|
||
3. Высокая чувствительность. Метод ПЦР позволяет выявлять |
|
||
даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика |
|
||
обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний |
|
||
в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, куль- |
|
||
туральными, микроскопическими) это сделать невозможно. Чув- |
|
||
ствительность ПЦР-анализа составляет 10–1000 клеток в пробе |
|
||
(чувствительность иммунологических и микроскопических тестов |
|
||
– 103–105 клеток). |
|
||
4. Универсальность процедуры выявления различных возбудите- |
|
||
лей. Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК |
|
||
возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или |
|
||
РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. |
|
||
Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет |
|
||
применять унифицированные методы проведения лабораторных |
|
||
исследований. Это дает возможность диагностировать несколько |
|
||
возбудителей из одной биопробы. В качестве исследуемого мате- |
|
||
риала могут использоваться различные биологические выделения: |
|
||
слизь, моча, мокрота, соскобы эпителиальных клеток, кровь, сы- |
|
||
воротка. |
|
||
5. Быстрота проведения анализа. Для проведения ПЦР-анализа |
|
||
не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что |
|
||
занимает большое количество времени. Унифицированный метод |
|
||
обработки биоматериала и детекции продуктов реакции, и автома- |
СЕМИНАРАМ |
||
тизация процесса амплификации дают возможность провести пол- |
|||
|
|||
ный анализ за 4–4,5 часа. |
|
||
6. Возможность диагностики не только острых, но и латентных |
|
||
инфекций. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики |
К |
||
трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих |
|||
МАТЕРИАЛЫ |
|||
форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталки- |
|||
|
|||
ваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот |
|
||
метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием |
|
||
таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение |
МЕТОДИЧЕСКИЕ |
||
ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбу- |
|||
|
|||
дителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных |
|
||
паразитов. |
|
||
Следует отметить, что методом ПЦР возможно выявление воз- |
|
||
будителей не только в клиническом материале, полученном от |
2. |
||
больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней |
|||
Раздел |
|||
среды (вода, почва и т.д.) |
|||
|
|||
|
|
|
|
373
Применение ПЦР в практическом здравоохранении
Использование метода ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний как бактериальной, так и вирусной природы, имеет колоссальное значение для решения многих проблем микробиологии и эпидемиологии. Применение этого метода также способствует развитию фундаментальных исследований в области изучения хронических и малоизученных инфекционных заболеваний. Однако следует отметить, что метод ПЦР лишь дополняет спектр традиционных методов, используемых в микробиологической диагностике. Наиболее рационально и эффективно применение ПЦР для обнаружения микроорганизмов трудно культивируемых в лабораторных условиях, атипичных форм бактерий. К ним также относятся внутриклеточные паразиты и микроорганизмы, способные длительно персистировать в организме хозяина. Высокоспецифичная, чувствительная и быстрая диагностика многих тяжелых заболеваний способствует не только их эффективному лечению, но и предотвращению распространения инфекции.
Рекомендуемая литература
1. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и соавт. ПЦР «в реальном времени». Под ред. Д.В. Ребрикова, – изд 2-е, испр. и доп. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. – 2009. – 223 с.
Материально-техническое обеспечение
Демонстрационные / раздаточные материалы, мультимедийная или проекционная демонстрационные системы, экран, лазерная указка.
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
374
Тема 9.3. «Методология проведения ПЦР анализа»*
Количество аудиторных часов – 1
Примерный план семинарского занятия
Вопросы, прорабатываемые на семинаре:
•Особенности выделения ДНК МБТ из диагностического материала и из культуры клеток
•Условия амплификации ДНК МБТ, использующиеся в существующих коммерческих наборах
•Детекция продуктов ПЦР в режиме реального времени
Цель семинара – формирование у слушателей представлений о методологии проведения ПЦР для выявления ДНК МБТ из диагностического материала, полученного от больного
Семинар проводится в интерактивной форме. При обсуждении темы также учитывается самоподготовка по модулю 9 «Молеку- лярно-генетические методы для выявления микобактерий туберкулезного комплекса и НТМБ» тема 9.2 «ПЦР-основа для молеку- лярно-генетических исследований во фтизиатрии»
Вводная часть (5–10 мин)
Ведущий семинара напоминает слушателям, что ПЦР является прямым методом для обнаружения возбудителя в диагностическом материале. Рассказывает, что к настоящему времени ПЦР широко применяется для диагностики вирусных и бактериальных инфекций, особенно ПЦР важна для диагностики СПИД и заболеваний, передающихся половым путем. Внедрение ПЦР в режиме реального времени позволило не только выявлять возбудителя, но и рассчитывать вирусную или бактериальную нагрузку (количественная ПЦР). Преподаватель подчеркивает, что и во фтизиатрии ПЦР нашли применение для выявления возбудителя МБТ, идентификации и определения лекарственной чувствительности к противотуберкулезным препаратам.
Основная часть (30 мин)
Основную часть семинара следует начать с описания этапов постановки анализа ПЦР на выявление ДНК МБТ из диагностического материала больных. Первым этапом является выделение ДНК МБТ. Преподаватель объясняет, что все методы выделения ДНК можно отнести к двум большим категориям – одношаговые способы выделения и многошаговые способы выделения. Приво-
*Демонстрационный материал к семинару представлен на диске. Может быть распечатан в качестве раздаточного материала.
Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ
375
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
дит пример самого простого одношагового способа выделения ДНК – прогревание материала при 95–99°C с последующим центрифугированием. Преподаватель описывает многошаговые методы выделения ДНК и подробно останавливается на каждом шаге (разрушение клетки с помощью гуанидина и тритона Х-100, сорбции ДНК на носителе (диатомовая земля, силика, акриламидный гель, магнитные частицы и др.), отмывка ДНК, связанной с носителем спиртовыми растворами, элюирование ДНК в ТЕ-буфер или воду). Преподаватель подчеркивает достоинства и недостатки одношагового и многошагового способов выделения. Преподаватель объясняет, что от правильно выбранного способа выделения зависит эффективность выделения ДНК и получение результатов, соответствующих истине. Далее преподаватель объясняет, какие проблемы возникают при выделении ДНК из M.tuberculosis:
1.Характер диагностического материала. Основным материалом для диагностики туберкулеза является мокрота, вязкий материал, плохо поддающийся лизису и вызывающий ингибирование ПЦР за счет веществ, остающихся в растворе ДНК после выделения. Поэтому перед выделением мокроту желательно разжижить и сконцентрировать. Для этого можно использовать предобработку мокроты по стандартному протоколу Becкton Dickinson (обработка NALC-NaOH, отмывка фосфатным буфером). Также отечественными фирмами разработаны специальные реагенты для предварительной обработки мокроты (НПФ «Синтол», Интерлабсервис).
2.Микобактерии имеют особую очень прочную клеточную стенку, состоящую из восков, миколовых кислот, белков и липидов (рис. 1). Для разрушения такой клеточной стенки необходимо применение довольно агрессивных реагентов в высокой
концентрации.
Преподаватель заключает, что для выделения ДНК МБТ из диагностического материла с максимально высокой эффективностью необходимо использовать многошаговые методы выделения ДНК. Применение одношаговых методов, хоть и снижает вероятность контаминации, многократно увеличивает число ложноотрицательных результатов. Преподаватель дает понятие о контаминации и рассказывает, какие меры ее профилактики следует применять – от правильного планирования помещений до каждодневной уборки рабочего места. Преподаватель подчеркивает, что внедрение автоматических систем для выделения ДНК МБТ, а также картриджной технологии помогает решить проблему конта-
376
минации (выделение ДНК производится автоматически, отсутствует человеческий фактор, следовательно, ошибки оператора исключаются)
Во второй части семинара преподаватель останавливается на условиях проведения ПЦР в режиме реального времени, которые используются в существующих коммерческих тест-системах. Преподаватель подчеркивает, что современные производители стремятся облегчить труд пользователя и продают тест-системы «в сборе», т.е. все компоненты реакционной смеси уже раскапаны по индивидуальным пробиркам. Исключение может составлять только фермент ДНК-полимераза, который надо закапывать отдельно, непосредственно перед проведением ПЦР, для исключения синтеза неспецифических продуктов (некоторые производители решили эту проблему и выпускают полностью собранные смеси в пробирках, включая ДНК-полимеразу). Преподаватель говорит, что в настоящее время необходимо использовать ПЦР в режиме реального времени, которая имеет ряд преимуществ (снижение времени проведения реакции, автоматизированная интерпретация результатов, уменьшение риска контаминации и т.д.). Все существующие отечественные фирмы, выпускающие наборы для детекции ДНК МБТ, производят их в формате реального времени.
В третьей части семинара преподаватель рассказывает о детекции результатов ПЦР в режиме реального времени. Дает представление о кинетической кривой и ее фазах, объясняет, от чего зависит длина каждой фазы. Объясняет, как проводить количественный или полуколичественный анализ, иллюстрируя объяснения графиками.
Заключительная часть
В заключении преподаватель еще раз подчеркивает важную роль ПЦР в генодиагностике туберкулеза
Краткий информационный материал к семинару модуля 9.
«Молекулярно-генетические методы для выявления микобактерий туберкулезного комплекса и НТМБ», Тема 9.3. «Методология проведения ПЦР анализа».
Достоинства и недостатки разных способов выделения Одношаговые
• Достоинства: быстрота, низкая вероятность контаминации.
Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ
377