6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

пирование, было проведено на 60 штаммах микобактерий W кластера и 60 штаммах кластера AI. Все микобактерии W кластера относились к сполиготипу Beijing, представленному двумя разновидностями. Большинство штаммов имело классический сполиготип 1–34 (58 изолятов (96,67%)) у двух изолятов также отсутствовал

спейсор №37 ( 1–34,37).

Микобактерии туберкулеза кластера AI были представлены 25 разновидностями сполиготипов, т.е. был чрезвычайно гетерогенен по данному маркеру, а представители этого кластера – эволюционно более дистанцированы, чем штаммы кластера W, и длительное время распространялись независимо.

Кроме того, полученные данные свидетельствуют о разном "возрасте" представителей двух штаммовых групп. Представители кластера AI–эволюционно более древние, и, скорее всего, эндемичные для территории РФ, т.к. в этой группе прослеживается низкий уровень кластеризации как при использовании типирования по ПДРФ IS6110, так и сполиготипирования. В то же время МБТ W кластера представляются более молодой группой, которая недавно циркулирует на данной территории, т.к. для них характерная высокая клональность.

Кроме того, если исходить из анализа сполигопрофилей штаммов МБТ этих двух кластеров, то можно подтвердить "молодость" штаммов W не только как недавно попавших на территорию РФ, но и эволюционно более молодое. Этот постулат базируется на числе спейсорных последовательностей у представителей двух кластеров. Преподаватель обращает внимание на то, что спейсорные последовательности в DR области генома могут только утрачиваться в процессе эволюции, поэтому, чем меньше спейсорных последовательностей регистрируется у штамма, тем он является более молодым. Микобактерии кластера W, относящиеся к Пекинскому сполиготипу, характеризуются наличием всего 9 спейсоров из 43, а штаммы AI кластера содержат значительно большее число спейсорных последовательностей – от 24 до 36.

Таким образом, генотипирование показало более низкую генетическую вариабельность микобактерий W-кластера и по ПДРФ IS6110 и по сполиготипу по сравнению со штаммами AI кластера, что говорит об активной трансмиссии МБТ W кластера. Особенности сполиготипов, а именно большое число утраченных спейсоров, позволяют отнести штаммы W-кластера к эволюционно молодым штаммам M.tuberculosis.

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

С целью закрепления знаний об основных группах штаммов, циркулирующих на территории РФ и особенностях их трансмиссии слушателям представляется для самостоятельного изучения статья "Трансмиссия штаммов микобактерий туберкулеза, обусловленная миграционными процессами в Российской Федерации (на примере миграции населения из Кавказского региона в Москву и Московскую область)" Андреевская С.Н., Черноусова Л.Н., Смирнова Т.Г., Ларионова Е.Е., Кузьмин А.В.

Заключительная часть

В заключении ведущий семинара отвечает на вопросы слушателей.

Рекомендуемая литература

1.Андреевская С.Н., Черноусова Л.Н., Смирнова Т.Г., Ларионова Е.Е., Кузьмин А.В. Трансмиссия штаммов микобактерий туберкулеза, обусловленная миграционными процессами в Российской Федерации (на примере миграции населения из Кавказского региона в Москву и Московскую область) // Проблемы туберкулеза и болезни легких. – 2006. – №1. – С. 29–35.

2.Черноусова Л.Н., Андреевская С.Н., Смирнова Т.Г., Катулина Н.И., Шудрова М.А. Генотипирование микобактерий, выделенных от больных туберкулезом из пенитенциарного учреждения // Проблемы туберкулеза. – 2001. – № 7. – С. 60–62.

3.Черноусова Л.Н., Карачунский М.А. Молекулярная эпидемиология туберкулеза // Проблемы туберкулеза. – 2007. – № 4. – С. 3–7.

4.Черноусова Л.Н., Голышевская В.И., Ерохин В.В., Кузнецов С.И., Захарова С.М., Мелентьев А.С., Федорин И.М., Николаевский В.В., Радди М., Балабанова Я.М., Дробневский Ф. Преобладание штаммов Mycobacterium tuberculosis семейства Beijing и факторы риска их трансмиссии в Самарской области // Проблемы туберкулеза и болезни легких. – 2006. – №2. – С. 31–37.

Материально-техническое обеспечение

Демонстрационные / раздаточные материалы, мультимедийная или проекционная демонстрационные системы, экран, лазерная указка.

Тема 8.5. «Применение методов молекулярной* эпидемиологии для решения клинических задач»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план семинарского занятия

Вопросы, прорабатываемые на семинаре:

•Генотипирование микобактерий в процессе химиотерапии

•Роль генотипирования МБТ для дифференциации эндогенной реактивации и экзогенного инфицирования больного туберкулезом

•Обнаружение инфицирования двумя штаммами

•Эпидемиологические расследования

Цель семинара – формирование у слушателей представлений о методах молекулярной эпидемиологии, применяемых для решения клинических задач.

Семинар проводится в интерактивной форме. При обсуждении темы семинара учитываются знания, полученные на прослушанных лекциях и семинарах Модуля 8. "Молекулярные методы в кластерном анализе микобактерий туберкулеза" по темам 8.1. "Мишени в геноме микобактерий, применяемые для кластерного анализа", 8.2. "Глобальные филогенетические группы микобактерий туберкулезного комплекса"; 8.3. "Основные кластерные группы микобактерий туберкулеза"; 8.4. "Молекулярная эпидемиология туберкулеза в России".

Вводная часть (5–10 мин)

Преподаватель фиксирует внимание слушателей, что генотипирование микобактерий может применяться для решения конкретных клинических задач, таких как изменение профиля штаммов в процессе химиотерапии, отличие эндогенной реактивации от экзогенного инфицирования, обнаружения инфицирования двумя штаммами, для проведения эпидемиологического расследования с целью обнаружения источника инфекции.

Основная часть (30 мин)

Преподаватель на практических примерах демонстрирует слушателям роль методов сполиготипирования и ПДРФ IS6110 для решения клинических задач. В качестве иллюстрации используется демонстрационный / раздаточный материал (см. презентацию).

*Демонстрационный материал к семинару представлен на диске. Может быть распечатан в качестве раздаточного материала.

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Преподавателем подчеркивается, что в процессе химиотерапии больным на все сроки обследования выделяются МБТ с идентичным генотипом. В качестве примера приводятся рис. 1 и 2, демонстрирующие сохранение ПДРФ IS6110 профилей гибридизации у больных на 3 и 4 срока обследования. Необходимо отметить, что типирование штаммов в процессе терапии возможно только до тех пор, пока больной является бактериовыделителем.

Преподаватель обращает внимание, что выделение штаммов МБТ с идентичными профилями гибридизации от разных пациентов, находившихся в контакте, может означать заражение от одного источника.

В качестве иллюстрации приводится рис. 3, показывающий штаммы МБТ с идентичными профилями гибридизации, выделенными от больных туберкулезом заключенных, пребывавших в одной камере. Преподавателем подчеркивается, что такой подход для определения источника заражения возможен только в случае выделения штаммов с генотипом, не характерным для конкретного региона. Так, например, выделение в РФ от двух больных штаммов с генотипом Beijing или W148 не обязательно будет свидетельствовать о наличии единого источника заражения, т.к. эти штаммы наиболее распространены на территории РФ, поэтому возможно независимое заражение и необходимы дополнительные маркеры для исследования, например, изучение ОНП.

Для примера, показанного на рис. 3, предположение об инфицировании от одного источника будет справедливым, поскольку штаммы кластера AI с идентичным профилем встречаются не часто (см. материалы семинара Модуля 8 "Молекулярные методы в кластерном анализе микобактерий туберкулеза", тема 8.4. Молекулярная эпидемиология туберкулеза в России").

Также на основе рис. 3 преподаватель иллюстрирует естественные эволюционные изменения штаммов МБТ в процессе химиотерапии. Преподавателем подчеркивается, что предположение о естественных эволюционных изменениях штаммов МБТ может делаться только в случае незначительных изменений профиля гибридизации. При типировании штаммов по ПДРФ IS6110 необходимо учитывать, что частота транспозиций элемента IS6110 относительно невелика, поэтому при естественных эволюционных процессах может фиксироваться утрата, приобретение или изменение местоположения только одного IS6110 элемента, как это видно на примере больного № 2. Также в качестве иллюстрации приводятся на рис. 4 и 5.

При сполиготипировании штаммов эволюционные изменения могут визуализироваться только в виде утраты одного из спейсоров. Поэтому наличие дополнительного спейсора на более поздние сроки обследования может указывать на лабораторную ошибку или суперинфицирование другим штаммом и требует проведения дополнительного расследования. В качестве иллюстрации утраты спейсора приводится рис. 6.

Если на более поздний срок обследования происходит кардинальная смена профиля гибридизации, выражающаяся в приобретении или утрате нескольких копий IS6110, спейсоров, а также при выделении штамма другого кластера, причины могут быть следующие:

1.Лабораторная ошибка при работе с диагностическим материалом.

2.Экзогенная суперинфекция.

Чтобы отличить лабораторную ошибку от других случаев, типируются штаммы, выделенные от больного, на еще один срок исследования. Если регистрируется первоначальный профиль гибридизации, то тогда речь идет о лабораторной ошибке, если продолжают выделяться МБТ с новым генотипом, то тогда речь идет о заражении новым штаммом.

Пример лабораторной ошибки представлен на рис. 7 и 8.

На рис. 9 показан пример суперинфицирования больного на второй срок обследования. Генотипированию были подвергнуты культуры больного из УИН. Культуру на более поздний срок получить не удалось, но условия работы при проведении данного исследования исключали возможность лабораторной ошибки.

При генотипировании методом IS6110 можно зарегистрировать инфекцию, вызванную двумя штаммами МБТ. В таком случае на профиле гибридизации фиксируется много полос разной интенсивности. Пример представлен на рис. 10. Там же дается иллюстрация элиминации одного из штаммов в процессе химиотерапии.

Иногда о наличии микс-инфекции можно судить только при генотипировании в процессе химиотерапии, как это показано на рис. 11 на примере инфицирования двумя штаммами кластера W с элиминацией одного из них в процессе химиотерапии.

Также преподавателю необходимо отметить, что в случае проведения эпидемиологического расследования, то есть выяснения источника заражения, применение стандартных методов генотипирования может оказаться недостаточным в случае выделения штаммов с распространенным генотипом. Тогда могут понадобиться дополнительные методы, например определение ОНП.

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

На рис. 12 представлена диаграмма с примером эпидемиологического обследования. От 17 больных были выделены микобактерии туберкулеза с идентичным генотипом – W148. Т.к. МБТ с таким генотипом являются самыми распространенными на территории РФ, для доказательства единого источника заражения необходимо было применить дополнительные методы. В данном случае было использовано определение ОНП в гене rpoB, ответственном за устойчивость к рифампицину. У 12 из 17 больных была выявлена мутация в 531 кодоне (TTG), поэтому для доказательства эпидемических связей между этими больными потребовались дополнительные доказательства. У 3-х больных из 12-и выделялись штаммы, имеющие отличающиеся ОНП в гене rpoB, что свидетельствовало об отсутствии эпидемических связей между этими случаями. У 2-х больных была зарегистрирована идентичная редкая двойная мутация в гене rpoB. Это дало возможность предположить о заражении этих больных из одного источника. Выяснение анамнестических данных этих больных подтвердило предположение о наличии между этими случаями эпидемической связи, т.к. больные являлись близкими родственниками.

Заключительная часть

В заключении ведущий семинара подчеркивает, что с помощью методов молекулярной эпидемиологии было показано, что что в процессе химиотерапии у большинства пациентов выделяются микобактерии с тем же генотипом, встречаются случаи инфицирования двумя штаммами и может происходить элиминация одного из штаммов. Дальнейшее развитие и внедрение в практику методов молекулярной эпидемиологии туберкулеза, помимо решения чисто научных проблем, будет способствовать совершенствованию противоэпидемических мероприятий и национальной программы контроля туберкулеза в целом.

Рекомендуемая литература

1.Черноусова Л.Н., Карачунский М.А. Молекулярная эпидемиология туберкулеза // Проблемы туберкулеза. – 2007. – № 4. – С. 3–7.

2.Bifani P. J., Shopsin B., Alcabes P., Mathema B., Kreiswirth B.N., Liu Z., Driscoll J., Frothingham R., Musser J.M. Molecular epidemiology and tuberculosis control // J.A.M.A. – 2000. – Vol. 284. – P. 305–307.

3.Cave M. D., Eisenach K.D., Templeton G., Salfinger M., Mazurek G., Bates J.H., Crawford J.T. Stability of DNA fingerprint pattern

produced with IS6110 in strains of Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiol. – 1994. – Vol. 32. – P. 262–266.

4.Cave M.D., Murray M., Nardell E. Molecular epidemiology of Mycobacterium tuberculosis // Tuberculosis and the tubercle bacillus / Edited by S.T. Cole. – Washington, ASM Press. – 2005. – P. 33–46.

5.Fleischmann R.D., Alland D., Eisen J.A., Carpenter L., White O., Peterson J., DeBoy R., Dodson R., Gwinn M., Haft D., Hickey E., Kolonay J.F., Nelson W.C., Umayam L.A., Ermolaeva M., Salzberg

S.L., Delcher A., Utterback T., Weidman J., Khouri H., Gill J., Mikula A., Bishai W., Jacobs W. R. Jr, Venter J.C., Fraser C.M. Whole–genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains // J. Bacteriol. – 2002. – Vol. 184. – P. 5479– 5490.

6.Gori A., Bandera A., Marchetti G., Esposti A. D., Catozzi L., Nardi

G.P., Gazzola L., Ferrario G., van Embden J. D., van Soolingen D., Moroni M., Franzetti F. Spoligotyping and Mycobacterium tuberculosis// Emerg. Infect. Dis. – 2005. – Vol. 11(8). – P. 1242.

7.Kamerbeek J., Schouls L., Kolk A., van Agtervveld M., van Soolingen D., Kuijper S., Bunschoten A., Molhuizen H., Shaw R., Goyal M., van Embden J.D.A. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology // J. Clin. Microbiol. – 1997. – Vol. 35. – P. 907–914.

8.Kremer K., van Soolingen D., Frothingham R., Haas W. H., Hermans P. W., Martin C., Palittapongarnpim P., Plikaytis B. B., Riley

L.W., Yakrus M. A., Musser J. M., van Embden J. D. Comparison of methods based on different molecular epidemiological markers for typing of Mycobacterium tuberculosis complex strains: interlaboratory study of discriminatory power and reproducibility // J. Clin. Microbiol. – 1999. – Vol. 37. – P. 2607–2618.

9.Sreevatsan S., Pan X., Stockbauer K.E., Connell N.D., Kreiswirth B.N., Whittam T.S., Musser J.M. Restricted structural gene polymorphism in the Mycobacterium tuberculosis complex indicates evolutionarily recent global dissemination // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. –

1997. – Vol. 94. – P. 9869–9874.

10.Supply P., Allix C., Lesjean S., Cardoso-Oelemann M., RuschGerdes, S., Willery E., Savine E., de Haas P., van Deutekom H., Roring S., Bifani P., Kurepina N., Kreiswirth B., Sola C., Rastogi N., Vatin V., Gutierrez M. C., Fauville M., Niemann S., Skuce R., Kremer K., Locht C., D. van Soolingen. Proposal for Standardization of Optimized Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit-Variable-

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ