6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Изучение особенностей метаболизма жиров и жирных кислот является важным, т.к. при росте in vitro M.tuberculosis предпочтительно метаболизируют углеводы, а при росте в инфицированном хозяине – жирные кислоты. Известно более 200 генов, вовлеченных в метаболизм жирных кислот, однако наиболее хорошо были изучены гены, кодирующие белки Icl, LipF, FadD33, Фосфолипазу С, PanC/PanD.

Гены биосинтеза аминокислот и пуринов, изученные с точки зрения взаимодействия с макроорганизмом, в результате своей экспрессии производят белки LeuD, TrpD, ProC.

Изучение генов потребления металлов, вовлеченных в транспорт и метаболизм ионов железа и магния, обусловлено тем, что магний и железо являются необходимыми для жизни, и нарушение потребления этих элементов часто уменьшает вирулентность бактериальных патогенов. К ним относятся белки MgtC, MbtB, IdeR.

Белки анаэробного дыхания и окислительного стресса (нитратредуктаза, KatG, AphC, SodA, SodC) являются важными для выживания M.tuberculosis в организме хозяина, т.к. фагоцитирующие клетки продуцируют окислительные радикалы для уничтожения попавших в организм бактерий, а экспрессия этих генов M.tuberculosis позволяет отвечать на различные внешние окислительные стрессы.

В третью группу генов, ответственных за взаимодействие пато- ген-хозяин, входят гены, кодирующие белки – регуляторы транскрипции, способные контролировать транскрипцию многих генов. В эту группу входят сигма-факторы, регуляторы ответа и другие регуляторы транскрипции.

Сигма-факторы входят в состав РНК-полимеразных полных ферментов с разными промоторными специфичностями и позволяют осуществлять транскрипцию генов, требуемых для условий, в которых оказываются M.tuberculosis, попадая в организм хозяина. Изучены функции Sigma A, Sigma F, Sigma E, Sigma H.

Регуляторы ответа – белки, регулирующие транскрипцию определенного гена, входящие в состав сигнальной трансдукционной цепи, как правило, двухкомпонентной. Первый компонент этой цепи – рецепторный белок гистидин-киназа, который улавливает сигналы окружающей среды и передает их второму компоненту цепи – белку-регулятору, отвечающему за регуляцию транскрипции определенных генов. Известны белки – регуляторы ответа PhoP, PrrA, Rv0981.

В дополнение к сигма-факторам и регуляторам ответа бактерии используют другие типы регуляторов транскрипции для контроля экспрессии большой группы генов. В геноме M.tuberculosis существует много открытых рамок считывания, которые описываются как регуляторы транскрипции, но их функции в общей физиологии и вирулентности M.tuberculosis изучены мало. К ним относятся, например, hspR, whiB3 и relA.

Заключительная часть

В заключение преподаватель еще раз подчеркивает, что все вышеперечисленные гены, необходимые для выживания M.tuberculosis внутри хозяина, были изучены при создании штаммов-мутан- тов, у которых в лабораторных условиях инактивирован изучаемый ген, путем сравнения биологических свойств штамма-мутанта и родительского штамма дикого типа.

Рекомендуемая литература

1.Smith I. Mycobacterium tuberculosis Pathogenesis and Molecular Determinants of Virulence // Clin. Microb. Rev. – 2003. – Vol. 16 (3).

– P. 463–496.

2.Traccas J.A., Gicquel B. Life on the inside: Probing Mycobacterium tuberculosis gene expression during infection // Immun.Cell Biol. – 2000. – Vol. 78. – P. 311–317.

Материально-техническое обеспечение

Флип-чарт, маркеры, фломастеры, лазерная указка, мультимедийное оборудование, экран

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Тема 7.4. «Генетические основы* персистенции микобактерий в макроорганизме»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план семинарского занятия

Вопросы, прорабатываемые на семинаре:

•основные гены микобактерий, ответственные за проникновение и внутриклеточное существование

•альтернативные пути метаболизма МБТ при персистенции в макроорганизме Цель семинара – формирование у слушателей современных

представлений о генах микобактерий, ответственных за выживание в условиях гранулемы, и их значении в регулировании метаболизма микобактерий.

В ходе семинара слушатели приобретают современные знания об основных моделях изучения генов МБТ, вовлеченных в персистенцию. Преподаватель излагает материал, представленный в современных зарубежных публикациях, формируя у слушателей представление об основных подходах, применяемых при изучении персистенции МБТ.

Семинар проводится в интерактивной форме. Преподаватель излагает материал, описанный в современных зарубежных публикациях, сопровождая свой рассказ презентацией, иллюстрирующей метаболические процессы персистирующих микобактерий. При проведении семинара учитываются знания, полученные на лекции Модуля 7 «Гены микобактерий и микобактерий туберкулезного комплекса», тема 7.2. «Геномная организация микобактерий туберкулезного комплекса».

Вводная часть (5–10 мин)

Преподаватель фиксирует внимание слушателей на том, что для выживания в организме хозяина микобактерии туберкулеза после фагоцитоза перепрограммируют макрофаги для предотвращения своей деструкции; инициируют формирование гранулем для создания окружающей среды, изолирующей МБТ от иммунной системы хозяина, прекращают свой основной метаболизм и терминируют репликацию, переходя в стадию дормантности.

*Демонстрационный материал к семинару представлен на диске. Может быть распечатан в качестве раздаточного материала.

Основная часть (30 мин)

Преподаватель фиксирует внимание слушателей на определении понятий «дормантность» и «персистирование». Преподавателем подчеркивается, что состояние дормантности описано для большинства природных экосистем (растения, вирусы, бактерии и т.д.). Состояние дормантности – период в жизненном цикле организма, когда рост и развитие временно остановлены. Это минимизирует метаболическую активность и, следовательно, помогает организму сохранять энергию. Состояние дормантности тесно связано с условиями окружающей среды. Дормантные микобактерии

– нереплицируемые формы микобактерий.

Персистенция – способность патогенных видов микроорганизмов к длительному выживанию (переживанию) в организме хозяина.

Персистенцию понимают неоднозначно. Одни исследователи к персистенции относят все случаи длительного нахождения патогенных микробов в организме, в том числе и в активной форме, например, при хронических заболеваниях, носительстве. Другие исследователи в понятие персистенции включают только переживание возбудителя в организме, без активного его размножения и метаболизма, в покоящейся форме. Покоящиеся формы микобактерий слабо иммуногенны и вирулентны, и отграничены от окружающей среды макроорганизма в гранулемах. Вследствие этого такие формы менее доступны элиминирующему давлению иммунной системы организма хозяина, что, вероятно, и лежит в основе их длительного переживания.

Преподаватель демонстрирует схему вариантов развития туберкулезного процесса при попадании в макроорганизм (схема 1), и обращает внимание слушателей, что персистенция возбудителя возникает только в случае нормального функционирования иммунной системы хозяина. При снижении иммунитета или исходном иммунодефицитном состоянии развивается активный туберкулез.

При описании основных подходов для изучения генов, ответственных за переход в дормантность, преподаватель подчеркивает, что существует два направления исследований. В одном случае исследуются штаммы МБТ дикого типа (лабораторные или клинические), в другом случае создаются генно-инженерные мутанты, у которых инактивируют тот или иной ген.

Вовлекая слушателей в дискуссию, преподаватель предлагает обсудить, какие из групп генов, изученных ранее на лекции Мо-

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

дуля 7 «Гены микобактерий и микобактерий туберкулезного комплекса», тема 7.2. «Геномная организация микобактерий туберкулезного комплекса» могут быть перспективны для изучения персистенции микобактерий.

Базируясь на схеме 2, преподаватель описывает каскад событий, происходящих в микобактериальной клетке под действием условий, в которых оказывается патоген при попадании в макрофаги.

Микобактерия, будучи фагоцитированной макрофагом, оказывается в условиях фагосомы, где испытывает существенный недостаток в кислороде и питательных веществах. Такое изменение условий внешней среды, фиксируясь рядом сигнальных молекул микобактериальной клетки, приводит к изменению экспрессии генов-регуляторов транскрипции. Это ведет к снижению транскрипции генов основного метаболизма, и индукции генов, запускающих метаболические пути, позволяющие МБТ выжить в неблагоприятных условиях.

Данные метаболические пути направлены на переход на метаболизм по типу строгого ответа, использование в качестве источника энергии жирных кислот хозяина, биосинтез пантотената de novo и перестройку дыхательной цепи на анаэробное дыхание. Кроме того, под действием неблагоприятных условий среды в микобактериальной клетке увеличивается содержание белков-шапе- ронов.

Основным геном, регулирующим транскрипцию других генов, активирующимся при попадании МБТ в неблагоприятные условия, является ген dosR, продукт которого влияет на комплекс из 53 генов, разбросанных по всему геному, которые формируют т.н. «регулон дормантности». Регулон дормантности включает гены, вовлеченные в анаэробное дыхание и липидный метаболизм.

Важность генов, входящих в регулон дормантности, для выживания микобактерий в условиях, обедненных по кислороду и питательным веществам, была проиллюстрирована Leistikow R.L. с соавт. (2009 г.). Было проведено исследование на генно-инженер- ном мутанте, у которого инактивировали 3 из 53 генов регулона. Использование красителей, селективно выявляющих живые МБТ, показало, что в старой культуре (100 дней культивирования) не было выявлено живых мутантных микобактерий, в то время как клетки M.tuberculosis H37Rv дикого типа сохраняли на этот срок свою жизнеспособность.

Под воздействием генов-регуляторов метаболизм микобактерий меняется. Во-первых, происходит перестройка метаболизма по типу строгого ответа, который является реакцией бактериальной клетки на голодание по аминокислотам, и проявляется в резком снижении синтеза тРНК и рРНК (в 10–20 раз) и образования рибосом. Строгий ответ обеспечивает выживание бактериальных клеток в неблагоприятных условиях за счет экономии ресурсов. В M.tuberculosis строгий ответ управляется геном relA, который снижает экспрессию генов, кодирующих 54 из 58 рибосомальных белков, тем самым даун-регулируя трансляционный аппарат МБТ.

Особое внимание при обсуждении метаболических особенностей персистирующих М.tuberculosis следует уделить метаболизму жирных кислот. Deb C. с соавт. (2009 г.) экспериментально было показано, что в условиях гипоксии макрофаги депонируют в цитоплазме в виде липидных капель триацилглицерид (ТАГ), который, в свою очередь, накапливают в своих клетках микобактерии. Описано 15 генов M.tuberculosis, имеющих триацилглицерол-син- тазную активность. Наиболее активным и максимально экспрессируемым является ген tgl1. Запасенные ТАГ микобактерии используют в качестве источника энергии, необходимой для выживания, а именно в качестве начального субстрата клеточногоβ дыхания. Деградация жирных кислот происходит в цикле -окис- ления (схема 3, правая часть). Цикл повторяется до тех пор, пока вся жирная кислота не будет переработана в ацетил-КоА, который затем используется в дыхательном цикле.

Преподаватель фиксирует внимание слушателей, что у микобактерий, персистирующих в макрофагах, осуществляется анаэробный тип дыхания в глиоксилатном цикле (схема 3, левая часть). Глиоксилатный цикл рассматривают как видоизмененный цикл трикарбоновых кислот (ЦТК) за счет добавления двух дополнительных реакций, катализирующихся изоцитратлиазой и малатсинтазой. Остальные реакции глиоксилатного цикла катализируются теми же ферментами, что и в ЦТК. Для МБТ в условиях гипоксии показано существенное повышение уровня экспрессии генов icl1 и icl2, кодирующих изоцитратлиазу и умеренное повышение экспрессии гена mez, кодирующего малатсинтазу. В качестве акцептора электрона вместо кислорода у микобактерий туберкулеза, находящихся в условиях гранулемы, выступают окисленные соединения азота. Ферментом, катализирующим финальную стадию транспорта электрона – его перенос на нитратанион, является нитратредуктаза. У M.tuberculosis нитратредуктаза

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

кодируется генами narG, narH, narJ, narХ, входящими в регулон дормантности.

Преподаватель отмечает, что важное участие в реакциях обмена веществ, перенося ацильные группы с одного вещества на другое, принимает кофермент А (на схеме 3 – Coа). В его состав входит пантотеновая кислота. В дормантном состоянии M.tuberculosis переходят на синтез пантотената из максимально простых предшественников. С этим связано повышение экспрессии генов panC и panD, необходимых для синтеза пантената de novo.

Одним из характерных свойств M.tuberculosis, находящихся в условиях стресса, является повышенный уровень экспрессии генов, кодирующих белки-шапероны. Наибольший уровень экспрессии в ответ на гипоксию показан для генов, кодирующих альфа-кристаллин 1 (Rv031c, или hspX, или acr1) и альфа-кристал- лин 2 (akr2). Гены, кодирующие другие шапероны (groEL1 и groEL2), имеют среднюю величину индукции транскрипции в ответ на стрессовые условия.

Заключительная часть

В заключении ведущий семинара обобщает, что в условиях гипоксии у МБТ осуществляется перестройка обменных процессов по типу анаэробного дыхания и строгого ответа. Также, для восстановления белковых структур клетки в условиях стресса, повышается экспрессия шаперонов. В конце семинара преподаватель отвечает на вопросы слушателей.

Краткий информационный материал к семинару модуля 7.

"Гены микобактерий и микобактерий туберкулезного комплекса", тема 7.4. «Генетические основы персистенции микобактерий в макроорганизме»

Модели для изучения дормантности M.tuberculosis

1. На клинических и лабораторных штаммах МБТ

•Моделирование in vitro условий, которым, предположительно, подвергаются МБТ внутри гранулемы.

–Условия гипоксии (Модель Wayne).

–Культивирование при недостатке питательных компонентов среды.

–Комбинированная мультистрессовая модель.

Модель не позволяет учесть иммунный ответ и фагоцитирование макрофагами.

•Эксперименты ex vivo в культуре МФ. Показывают раннюю адаптацию к иммунному ответу хозяина, но не описывают ме-

таболические изменения через длительный промежуток времени.

•Эксперименты in vivo с заражением мышей. Имеется много общего с иммунным ответом человека, но не формируется типичная гранулема.

Вкаждой системе изучают уровень транскрипции генов МБТ. 2. На генно-инженерных мутантах

•На основе природных штаммов создаются мутанты с инактивированным геном, предположительно связанным с выживанием в макроорганизме.

•Мутанты проверяют на жизнеспособность в условиях in vitro, в МФ и in vivo по сравнению со штаммами с диким генотипом.

Клеточное или тканевое дыхание – совокупность биохимических реакций, протекающих в клетках живых организмов, в ходе которых происходит окисление углеводов, липидов и аминокислот до углекислого газа и воды. Высвобожденная энергия запасается в химических связях макроэргических соединений (АТФ и др.) и может быть использована по мере необходимости. Входит в группу процессов катаболизма. В качестве исходных субстратов дыхания могут выступать различные вещества, преобразуемые в ходе специфических метаболических процессов в Ацетил-КоА с высвобождением ряда побочных продуктов.

Если в качестве начального субстрата используютсяβ жирные кислоты, процесс их деградации происходит по типу -окисления жирных кислот. На первой стадии к жирной кислоте присоединяется кофермент А с образованием ацил-KoA. Он дегидрируется с последовательным переносом восстановительных эквивалентов на убихинон дыхательной ЭТЦ. На второй стадии происходит гидратирование по двойной связи С=С, после чего на третьей стадии происходит окисление полученной гидроксильной группы. В ходе этой реакции восстанавливаетсяβ НАД. Наконец, наβчетвёртой стадии образовавшаяся -кетокислота расщепляется -кетотиолазой в присутствии кофермента А на ацетил-КоА и новыйβ ацил-КоА, в которой углеродная цепь на 2 атома короче. Цикл -окисления повторяется до тех пор, пока вся жирная кислота не будет переработана в ацетил-КоА.

Анаэробное дыхание – биохимический процесс окисления органических субстратов или молекулярного водорода с использованием в дыхательной электрон-транспортной цепи в качестве конечного акцептора электронов вместо кислорода других окислителей неорганической или органической природы. Как и в

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

случае аэробного дыхания, выделяющаяся в ходе реакции свободная энергия запасается в виде трансмембранного протонного потенциала, использующегося АТФ-синтазой для синтеза АТФ.

Шапероны – класс белков, главная функция которых состоит в восстановлении правильной третичной структуры повреждённых белков, а также образовании и диссоциации белковых комплексов. Шапероны есть во всех живых организмах. Механизм действия – нековалентное присоединение к белкам и их «расплетение» с использованием энергии гидролиза АТФ. Многие шапероны являются белками теплового шока, то есть белками, экспрессия которых начинается в ответ на рост температуры или другие клеточные стрессы.

Рекомендуемая литература

1.Андреевская С.Н., Черноусова Л.Н., Смирнова Т.Г., Ларионова Е.Е. Особенность экспрессии генов icl и hspX, индуцируемых при выживании в организме хозяина, у штаммов Mycobacterium tuberculosis кластера W // Туберкулез и болезни легких. – 2011.

2.Cole S.T., Brosch R., Parkhill J. et al. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence // Nature. – 1998. – Vol. 393. – P. 537–544.

3.Deb C., Lee C.M., Dubey V.S., Daniel J., Abomoelak B. et al. A novel in vitro multiple-stress dormancy model for Mycobacterium tuberculosis generates a lipid-loaded, drug-tolerant, dormant pathogen //PLoS One. – 2009. – 4:e6077.

4.Gengenbacher M., Kaufmann S.H. Mycobacterium tuberculosis: success through dormancy // FEMS Microbiol. Rev. – 2012. – Vol. 36(3). – P. 514–532.

5.Murphy D.J., Brown J.R. Identification of gene targets against dormant phase Mycobacterium tuberculosis infections // BMC Infect.Dis.

– 2007. – Vol. 7. – P. 84.

6.Wayne L.G., Hayes L.G. An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through two stages of nonreplicating persistence // Infect. Immun. – 1996. – Vol. 64 (6). – P. 2062–2069.

Материально-техническое обеспечение

Флип-чарт, маркеры, фломастеры, лазерная указка, мультимедийное оборудование, экран

Тема 7.5. «Особенности генетики НТМБ»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план семинарского занятия

Вопросы, прорабатываемые на семинаре:

•Структурные гены, используемые для изучения филогении НТМБ

•Филогенетические древа, построенные на основе анализа нуклеотидной последовательности структурных генов Цель семинара – формирование у слушателей современных

представлений о молекулярно-генетических маркерах, используемых для изучения филогении НТМБ. На семинаре слушатель приобретает навыки работы с научными публикациями.

Семинар проводится в интерактивной форме. При обсуждении темы семинара должны учитываться материалы лекции по Модулю 7 «Гены микобактерий и микобактерий туберкулезного комплекса», тема 7.5. «Особенности генетики НТМБ».

Вводная часть (5–10 мин)

Рост числа заболеваний, вызванных НТМБ, способствовал тому, что исследование генома возбудителей микобактериозов является интенсивно развивающимся направлением в науке. На данный момент изучение генома НТМБ носит скорее прикладной характер, направленный на выявление маркеров для идентификации видов и изучения филогенетических связей между видами. В ходе семинара будут разобраны гены-мишени, используемые для установления таксономического родства между видами НТМБ, и филогенетические древа, построенные на основе применения разных маркеров.

Основная часть (30 мин)

Для самостоятельного изучения слушателям предлагается книга В.И. Литвинова, М.В. Макаровой, М.А. Красновой «Нетуберкулезные микобактерии». – М.: МНПЦБТ. – 2008. – 256 с. – Глава 1. Часть 1.3. «Филогенетическое родство и таксономическая классификация представителей рода Mycobacterium на основе секвенирования генов-мишеней». Преподаватель предлагает сделать конспект темы, желательно в виде таблицы, в которой отражены:

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ