6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_нарушений_гемостаза_Долгов

Рис. 73. Динамический агрегометр PFA-1OO. Он позво-

ляет наблюдать in vitro за процессом закупорки сосуда при моделировании этого процесса в специально созданном картридже. Образование тромбоцитарной пробки оценивается по перфузионному давлению

Рис. 74. Датчик динамического агрегометра PFA-1OO со-

держит капилляр, моделирующий микрососуд. В цельной крови, проходящей по капилляру, активируется образование сгустка, На стенках нанесен коллаген и адреналин или АДФ, которые являются первичной причиной запуска гемостаза

При подсчете на автоматических анализаторах тромбоциты распознаются по размерам в диапазоне 2-20 фл (рис. 75). Автоматические счетчики позволяют получать достаточно надежные результаты по количеству тромбоцитов. При подсчете тромбоцитов в камере Горяева коэффициент вариации составляет 7-15%, тогда как автоматический подсчет воспроизводится с точностью до 2-4%. Современные анализаторы сигнализируют (флагирование на бланке) о выходе количества тромбоцитов за референтные пределы, наличии агрегатов тромбоцитов, макротромбоцитов или других элементов, сравнимых по объему с тромбоцитами (микроэритроциты).

Ложное занижение числа тромбоцитов может быть при их агрегации, агглютинации под действием тромбоцитарных агглютининов и при прилипании тромбоцитов к лейкоцитам(тромбоцитарный «сателлитизм»). При подсчете на гематологических анализаторах в качестве антикоагулянта используется ЭДТА. При наличии аутоантител к тромбоцитам калиевая соль ЭДТА инициирует агрегацию тромбоцитов, что проявляется псевдотромбоцитопенией.

У здоровых людей MPV равен 6-12 фл и находится в обратной зависимости от числа тромбоцитов. Такое соотношение определяет постоянство тромбоцитарной массы в циркулирующей крови. MPV увеличивается с возрастом; отмечено, что у мужчин MPV несколько выше, чем у женщин.

Использование ЭДТА в качестве антикоагулянта вызывает изменение формы тромбоцитов от диска к сфере, что приводит к увеличению MPV на 10-12% в течение 2 часов, а затем показатель существенно не меняется. Под действием цитрата натрия MPV может уменьшаться или увеличиваться, а при высокой концентрации (1:4) - не изменяется со временем. Кроме типа применяемого антикоагулянта и времени от момента взятия пробы до исследования, на MPV оказывает влияние температура окружающей среды. Преходящее увеличение MPV отмечается у рабочих, контактирующих с асфальтовыми испарениями, органическими растворителями. MPV - важный диагностический показатель функции тромбоцитов. Причины изменения MPV представлены в табл. 13.

Таблица 13

Причины изменения MPV

Рис. 75. Гистограмма тромбоцитов, которая изобража-

ется при представлении результатов счета клеток крови на гематологических анализаторах, Помимо гистограммы, гематологические анализаторы представляют результаты подсчета количества тромбоцитов(PLT), среднего объема тромбоцитов (MPV), дисперсии распределения тромбоцитов по объему (PDW), тромбоцитокрита (РСТ)

Дисперсия распределения тромбоцитов по объему (PDW)

PDW - показатель, являющийся мерой гетерогенности размеров (анизоцитоза) тромбо-

ется прозрачность плазмы и, следовательно, увеличивается поток проходящего через кювету света (рис. 76). Изменение светопропускания регистрируется в виде кривой.

дин и клопидогрель селективно ингибируют активацию G-белка, АДФ-агрегацию и активность стимулированной аденилатциклазы.

Агрегация с АДФ

Характер агрегации тромбоцитов при индукции АДФ зависит от дозы. Как правило, при концентрации 0,5-1 мкмоль возникает обратимая агрегация, при концентрации до 5 мкмоль - двухфазная агрегация, при большей концентрации (до 10 мкмоль) - необратимая однофазная агрегация (или агрегация, при которой неразличим переход от 1-й до 2-й волны).

При связывании на поверхности тромбоцитов АДФ с рецептором происходит изменение формы тромбоцитов, экспозиция на мембране комплекса GPIIb-IIIa (рецептор для фибриногена) и первичная Са-зависимая агрегация. Если первичный ответ на АДФ не будет поддержан вторичной реакцией, то в отсутствии фибриногена происходит десенситизация рецепторов, которая приводит к дезагрегации тромбоцитов. Вторичная агрегация опосредована внутриклеточной передачей сигнала через G-белки с повышением

2+

внутриклеточной концентрации Са. Происходит активация простагландин-тромбоксановой системы, развивается секреция из α-гранулvWF, β-тромбоглобулина, тромбоспондина, фибронектина и других активных компонентов, развивается вторичная агрегация.

Выяснение путей АДФ-активации тромбоцитов позволило использовать в клинике антиагрегационные соединения. Оказалось, что тиклопи-

Агрегация с адреналином

Особенности агрегации с адреналином в значительной степени обусловлены концентрацией Са2+ в среде. При физиологических концентра-

2+

циях Са (1-2 ммоль, которая характерна для плазмы крови) адреналин не вызывает активации тромбоцитов и их агрегации. При значи-

2+

тельном снижении Са в цитратной плазме до2040 мкмоль адреналин вызывает дозозависимую агрегацию с экспрессией комплексаGPIIb-IIIa при первичной волне агрегации и ТХА2-опосре- дованную вторичную волну (рис. 28).

По-видимому, в условиях организма прямая адреналиновая агрегация отсутствует, что связа-

2+

но с относительно высокой концентрацией Са в плазме и низкой концентрацией самого адреналина. Однако адреналин, очевидно, потенцирует действие других агонистов, что проявляется уже при его концентрации порядка 0,01 мкмоль. Поэтому при курении, стрессе и особенно кардиогенном шоке, когда уровень адреналина в крови повышается до 0,6 мкмоль, он становится существенным фактором внутрисосудистой агрегации тромбоцитов.

Агрегация с тромбином

Тромбин - очень сильный физиологический индуктор агрегации. Воздействие тромбина на тромбоцит опосредовано собственным рецепто-

ром (рис. 20) и GPIbα. Стимуляция тромбинового рецептора сопровождается активацией тромбоцитов через G-белок, фосфолипазы С и включение фосфоинозитольного механизма активации. Этот путь сопровождается быстрым увели-

2+

чением концентрации цитозольного Са и секрецией α-гранул и электронно-плотных5-гранул. Секретируемый из 5-гранул АДФ существенен для образования агрегатов, а выделяемые α-гра- нулами фибриноген, vWF, тромбоспондин - для их стабилизации. Оккупация молекулами тромбина высокоаффинных рецепторов GPIbα приводит к перестройке фосфолипидной мембраны, стимуляции ее прокоагулянтной активности и повышению аффинности GPIIb-IIIa. В результате комплексной стимуляции тромбином практически не наблюдается двухволновой агрегации.

Агрегация с арахидонатом

Арахидоновая кислота в цитратной плазме вызывает дозозависимое изменение формы тромбоцитов, первичную и вторичную агрегацию. Арахидонат активирует тромбоциты без участия специфических рецепторов, проникая внутрь клетки, активируя свои метаболиты - ПГG2,

ПГН2 и тромбоксан. Эту особенность активации тромбоцитов арахидоновой кислотой используют для дифференциации нарушений, связанных с дефицитом пулов хранения и нарушениями в циклооксигеназном пути активации тромбоцитов.

Вид агрегатограммы зависит от типа и концентрации индуктора. Наиболее распространенные индукторы АДФ и адреналин используются в нескольких концентрациях. Форма агрегатограммы может быть несколько отлична на агрегометрах разных производителей, так как выводимый результат теста в определенной степени зависит от скорости и характера перемешивания, температуры, способа регистрации и некоторых других факторов.

Лекарственные средства, такие, как аспирин и другие нестероидные противовоспалительные препараты, антибиотики (3-лактамного ряда, некоторые витамины, пряности могут быть причиной нарушенной агрегации. Из вышесказанного следует, что для адекватной оценки результатов теста требуется тщательная стандартизованная подготовка больных и стандартизация протокола аналитических процедур.

Болезнь Виллебранда и врожденные нарушения функции тромбоцитов легко диагностируются агрегатометрией (табл. 14).

Клинический пример 2

Мальчик А. 6 лет. Обратился за помощью по поводу носового кровотечения. Со слов родителей - единственный ребенок в семье, имеющий геморрагические проявления в виде кожного гемосиндрома, гемартрозов и носовых кровотечений. Ребенок наблюдается по месту

жительства с диагнозом гемофилия А. При носовых кровотечениях и гемартрозах получает переливания цельной крови с положительным эффектом. При осмотре, помимо кровотечения из полости носа, выявлен кожный гемосиндром смешанного типа - гематомы, экхимозы, петехии и пурпурозные элементы. Для оказания экстренной помощи был введен концентрат фак-

Коагуляционные, или клоттинговые, методы основаны на определении промежутка времени от добавления стартового реактива, запускающего каскад свертывания плазмы, до момента образования сгустка (выпадения фибрина). При постановке коагуляционных тестов необходимо перемешать плазму с реактивом до гомогенной суспензии и поддерживать стабильной температуру реакции. Коагуляционные тесты - в настоящее время наиболее распространенный методический подход для оценки плазменного гемостаза в кли- нико-диагностических лабораториях. Необходимо подчеркнуть, что коагуляционные методы являются скрининговыми, тем не менее на их основе сконструирован ряд методов для оценки активности факторов плазмы.

Ручные методы

Ручные методы обнаружения момента выпадения сгустка проводятся на водяной бане. Автоматическая регуляция температуры воды только частично решает проблему поддержания постоянной температуры. Частое вынимание пробирки во время исследования для наблюдения за появляющимся сгустком является причиной того, что температура реакции не соответствует температуре водяной бани. При визуальной оценке времени появления сгустка даже опытному лаборанту невозможно точно установить момент появления сгустка, что является главной причиной плохой повторяемости результатов. Однако следует помнить, что в ситуациях, в которых отсутствуют или подводят автоматические методы

(формируется неплотный сгусток), применение этого метода обоснованно.

Точность определения времени больше зависит от исследователя, чем от типа используемого в исследованиях секундомера. Удовлетворительной следует считать точность определения времени до 0,5 с. К недостаткам этого метода можно отнести длительность его выполнения и необходимость максимального внимания во время проведения исследования.

Автоматизированные коагулометры

Автоматизированные коагулометры существенно улучшили точность и повторяемость результатов коагуляционных тестов, уменьшили влияние человеческого фактора. В настоящее время имеется большой выбор различных приборов для исследования гемостаза, начиная от самых простых, в которых автоматизирован лишь процесс фиксации момента свертывания крови, до сложных машин, требующих лишь установить отцентрифугированные пробирки в штатив и задать программу исследований. В последние годы появляются биохимические анализаторы, в которых предлагаются программы для регистрации коагуляционных тестов методом турбидиметрии по резкому изменению светопропускания в момент свертывания плазмы. Все это значительно расширило возможности оценки гемостаза в кли- нико-диагностических лабораториях. В то же время исследование гемостаза по-прежнему предъявляет высокие требования к преаналитическому этапу, качеству подготовки проб, квалификации лаборантов, проводящих исследования.

В последние несколько лет в аналитическом подходе к оценке гемостаза, в том числе и из-за внедрения автоматизации, существенно повышены требования к стандартизации. Стандартизация рассматривается как спектр приемов исследования гемостаза, обеспечивающий воспроизводимые в разных лабораториях результаты за счет применения разовых систем взятия крови, аттестованных методов, реактивов, приборной базы, международных стандартов при калибровке, проведения внутрилабораторного контроля качества, участия во внешнем и международном контроле качества и др. Наиболее ярким примером такого подхода является переход от определения нестан-

дартизованного протромбинового индекса к определению международного нормализованного отношения (MHO) при использовании аттестованного по международным стандартам тромбопластина (см. ниже). Однако многие коагуляционные методы плохо поддаются стандартизации, в том числе такой широко распространенный тест, как активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ).

В основе регистрации момента выпадения сгустка в коагулометрах используются несколько принципов: механический, турбидиметрический, оптико-механический. Каждый из них имеет свои преимущества и недостатки, которые важно знать при интерпретации результатов исследований (см. ниже).

Ограничения коагуляционных методов:

•Ограниченное время регистрации. Тест дол жен быть проведен в течение примерно 10200 с. Это возможно далеко не для всех ана лизов.

•Далеко не все компоненты гемостаза можно исследовать по времени образования сгуст ка. Компоненты системы фибринолиза, инги биторы не оказывают прямого влияния на время свертывания, и их количественная оценка не поддается исследованию клоттинговым методом.

•Метод чувствителен к различным неспеци фическим внешним воздействиям. Напри мер, исследование активности ф.VIII клоттинговым методом невозможно у пациента, получающего терапию гепарином или непря мыми антикоагулянтами, хотя ни те ни дру гие не оказывают непосредственного влия ния на этот фактор.

•Метод малочувствителен для определения повышенной активности компонентов систе мы свертывания крови.

•Для ряда тестов сложно создать устойчивые реактивы, удобные для применения в диаг ностических лабораториях. Существенной проблемой на этом пути является использо вание активаторов плазменных факторов, в частности использование на первом этапе ак тиваторов протеолитических реакций. Акти ваторы могут быть нефизиологическими, ко торые имитируют твердую фазу поверхнос ти (каолин, целит), или физиологическими