4 курс / Дерматовенерология / От меланоцитов до меланомы

Cancer Chameleon

Рисунок 4. Биологические характеристики различных по морфологическим свойства меланоцитарных новообразований. Меланоцитарные новообразования становятся по мере своей развития пролиферативно активнее и поликлональными. Большинство точечных мутаций, вызванных УФ-излучением, накапливаются до момента перехода в инвазивную меланому. Как только меланома становится инвазивной, изменение числа копий увеличивается. PCNA, ядерный антиген пролиферирующих клеток (Proliferating cell nuclear antigen).

Споры о диспластическом невусе. Хорошо известно, что у некоторых меланом есть предшественники — увеличенные невусы, которые связаны с повышенным риском развития меланомы80,81. Такие невусы назвали диспластическими, так как они имеют различные клинические и морфологические особенности. Подобные поражения могут спорадически возникать у людей из семей, не предрасположенных к меланоме82. Клинически диспластический невус определяется как пятно коричневого цвета с диаметром не менее 5 мм, обладающее как минимум двумя из следующих характеристик: изменчивая пигментация, асимметрия и/или прерывистые или нечеткие границы83.

Определенные гистологические особенности связаны с диспластическими невусами; однако эти особенности плохо коррелируют с риском появления меланомы у пациента и, следовательно, остаются источником постоянных споров в профессиональных сообществах78. Конференция Национального института здоровья США (NIH) определила диспластические невусы как поражения с нарушением гистоархитектоники, такими как слияние меланоцитарных гнёзд в межпапиллярном пространстве, субэпидермальная фиброплазия, инфильтрация дермы лимфоцитами и лентигинозная меланоцитарная гиперплазия с веретенообразными или эпителиоидными скоплениями меланоцитов различного размера82. Кроме того, имеются классификации с градацией диспластических невусов по атипии на, умеренные и тяжелые, предполагая, что риск прогрессирования меланомы представляет собой градацию, которая коррелирует с гистологическими особенностями самих образований84. Однако определение подобной градации между отдельными специалистами различается85–88. Некоторые врачи пытаются сделать реэкцизию не полностью иссеченных невусов, которые гистологически диагностированы как диспластические невусы. Они воспринимают их как пограничные злокачественные новообразования, тогда как другие врачи считают их полностью доброкачественными. Как следствие, диспластические невусы диагностируются и лечатся непоследовательно89.

Cancer Chameleon

Ключевой вопрос, лежащий в основе загадки диспластических невусов, заключается в том, действительно ли существует биологическая промежуточная категория между доброкачественным и злокачественным, или промежуточная категория является просто миражом, отражающим ограничения гистологической оценки. Недавний генетический анализ показал, что невусы, однозначно классифицированные как доброкачественные несколькими независимыми наблюдателями, неизменно имели только одну мутацию-драйвер - BRAFV600E - тогда как промежуточные поражения с большим количеством диспластических невусов имели множественные драйверные мутации30. Драйверные мутации в промежуточных поражениях включали мутации, которые, как известно, активируют передачу сигналов MAPK, и, кроме того, мутации промотора TERT или гемизиготные изменения CDKN2A. Промежуточные новообразования со злокачественным потенциалом также имели высокую мутационную нагрузку, чем у однозначно доброкачественных, и ниже, чем у злокачественных новообразований. Эти данные подтверждают существование биологической промежуточной категории, вселяя в нас надежду на то, что морфологические критерии этих поражений будут уточнены в будущих исследованиях.

Формирование диспластических невусов. Клинические и гистологические данные свидетельствуют о том, что синдром диспластического невуса, то есть множественные клинически выраженные диспластические невусы, связанные с риском наследственной меланомы, возникает de novo, а не из ранее существовавших обычных невусов. Синдром диспластического невуса обычно возникает в семьях с высокой заболеваемостью меланомой78. Примеры вариантов в зародышевой линии, которые обеспечивают высокую встречамость меланомы, включают в себя: CDKN2A, циклин-зависимую киназу 4 (CDK4), TERT и белок защиты теломер 1 (POT1)36,90–93, хотя невусы, связанные с TERT и POT1 не описаны в литературы. Эти же гены или пути, по которым они действуют, часто подвергаются соматическим мутациям при спорадических меланомах. Таким образом, меланоциты пациентов с такими изменениями зародышевой линии уже унаследовали один из множественных патогенных вариантов, обнаруженных в меланомах (рис. 3, шаг 5). Как только эти меланоциты приобретают инициирующую мутацию, которая активирует пролиферацию, предположительно по пути MAPK, это может привести к снижению способности сдерживать пролиферацию меланоцитов, что приведёт к увеличению числа и размеров невусов. Таким образом, патогенные изменения могут существовать в меланоците до появления заметного новообразования и обнаруживаться только в контексте приобретенной мутации, что в некоторых случаях приводит к тому, что эволюция опухоли пропускает морфологически отдельную стадию.

В отличие от синдромах диспластических невусов, в клетках спорадических невусов также есть некоторое количество патогенных изменений, но, все эти мутации приобретаются соматически. Это согласуется с наблюдением, что подобные диспластические невусы демонстрируют более высокую общую мутационною нагрузку, чем обычные невусы30, так как это характерно для множественных патогенных мутаций. Интересно, что, похоже существуют дополнительные различия в генетическом «ландшафте» спорадических диспластических невусов. По сравнению с высокой распространенностью мутаций BRAFV600E в обычных невусах, спорадические диспластические невусы богаты мутациями NRAS и BRAFnonV600E30 (рис. 3, шаг 12). Это опровергает то, что диспластические невусы возникают из обычных невусов - поскольку обычные невусы чаще имеют мутации BRAFV600E - из чего можно предположить, что некоторые спорадические диспластические невусы следуют отдельной эволюционной траектории в своём развитии.

Cancer Chameleon

Морфология и подтипы. Меланома in situ может быть предшественником как ХПС-, так и неХПС-меланом (см. рисунок 3). Можно выделить два основных типа меланомы in situ, которые ассоциируются с различными путями прогрессии: с педжетоидной и лентигинозной моделью роста. Педжетоидный паттерн роста ассоциирован с мутациями BRAFV600E4, что связавывает эти новообразования с развитием в неХПС-меланомы или с поверхностно-распространенной меланомой (см. рисунок 3, этап 3). Напротив, лентигинозный паттерн роста характеризуется меланоцитами, единично расположенными вдоль базального слоя эпидермиса. Данный паттерн имеет обратную корреляцию с мутациями BRAFV600E, поэтому он связан с развитием ХПС-меланом (см. рисунок 3, этап 10). Акральная меланома и меланома слизистых оболочек также характеризуются лентигинозным подтипом меланомы in situ. Лентигинозная форма новообразования может поражать несколько квадратных сантиметров кожи за несколько лет до момента начала инвазии и формирования узла. Подобный тип меланомы in situ на ХПС коже называется злокачественным лентиго, а меланомы – лентиго-меланомами (см. рисунок 3, этап 11). Лентигинозные подтипы меланомы in situ преимущественно встречаются у пожилых людей.

Предшественники меланомы in situ. Меланома in situ на ХПС коже обычно возникает de novo без наличия предшествующего невуса26. Клетка-предшественник при этом неизвестна (см. рисунок 3, этап 9). Высокая мутационная нагрузка указывает на то, что это может быть поверхностно-расположенный меланоцит, который мог остаться в межфолликулярном эпидермисе. Злокачественное лентиго может происходить из клеток-предшественников, расположенных в волосяных фолликулах. Меланоциты в других придатках кожи, например в потовых железах, являются клетками предшественниками акральной меланомы103. Меланомы, возникающие в невусе обычно развиваются внутриэпидермально, как меланома in situ с педжетоидным паттерном роста (см. рисунок 3, этап 3). Анализ мутаций показал, что мутагенез происходит в поверхностных меланоцитах невуса в связи с воздействием УФ-излучения. Это преобладающий путь мутагенеза, приводящий к прогрессии невуса до меланомы с промежуточным этапом в виде меланомы in situ30.

Генетика меланомы in situ. Изучение генетических особенностей меланомы in situ – трудная задача в связи с небольшим количеством клеток. Секвенирование, направленное на выявление мутаций в BRAF, NRAS и TERT при микродиссекции ткани показало, что меланома in situ имеет достаточно редкие мутации104,105. Но, вполне вероятно, что подобный результат связан с низкой чувствительностью секвенирования по Сэнгеру при меланоме in situ и тонкой меланоме. Использование методов с высокой чувствительностью позволили выявить более высокую частоту мутаций, затрагивающих сигнальный путь MAPK через BRAF, NF1 и NRAS30,106-108. В меланомах in situ также часто встречаются мутации промотора TERT30 и гетерозиготные повреждения в CDKN2A30.

Развитие меланомы in situ. Меланомы in situ имеют длительный период накопления мутаций, что свидетельствует об их медленном развитии и позднем возрасте появления. Это особенно характерно для NF1-мутантных новообразований, характерных для пожилых пациентов21,109. Несмотря на то, что многие мутации происходят по взаимоисключающим путям, мутации NF1 соседствуют с другими изменениями в сигнальном пути MAPK110,111. Это указывает на то, что мутация в NF1 с потерей функции является слабым активатором сигнального пути MAPK, и поэтому новообразование должно приобрести другие мутации, обеспечивающие выраженную

Cancer Chameleon

активацию данного пути, что и объясняет поздний возраст появления данного типа меланомы in situ.

Меланома in situ более распространена на коже с хронической инсоляцией и имеет высокую мутационную нагрузку, связанную с воздействием УФ-излучения. Это подтверждает спектр выявляемых мутаций, таких как мутации промотора TERT и мутации в генах онкосупрессорах. Исходя из этого можно сделать вывод, что ультрафиолетовое излучение – основной патогенный фактор развития меланомы коже, подвергающейся воздействию солнца (см. рисунок 4).

Меланомы in situ могут сохраняться в течение нескольких лет до перехода в стадию инвазивного роста112, что свидетельствует о необходимости появления дополнительных мутаций. Мы предполагаем, что эти дополнительные генетические изменения необходимы для преодоления биологической зависимости от эпидермального окружения, которое по видимому объясняет то, что клетки меланомы in situ трудно культивируются и нуждаются в большем количестве факторов роста, чем клетки инвазивной меланомы113-115. Тем не менее, уклонение от иммунной системы может быть дополнительным требованием для перехода в стадию инвазивного роста. Интересно, что меланомы in situ, несмотря на их тенденцию к долгой прогрессии, отличаются высокой пролифераций, что подтверждается экспрессией ki-67 по сравнению с обычными или диспластическими невусами116. Это отличие, наряду с обнаружением мутаций в промоторе TERT указывает на значительную пролиферацию клеток.

Инвазивная меланома

Когда клетки меланомы in situ покидают эпидермис и попадают в дерму или подслизистую основу, меланому называют инвазивной. В отличие от многих эпителиальных новообразований, способность инвазировать в дерму не является признаком злокачественной опухоли, так как многие невусы характеризуются наличием меланоцитов в дерме. Важно отметить, что риск метастатической болезни и смерти у меланом коррелирует с глубиной инвазии100. Многие инвазивные меланомы возникают из меланомы in situ, которые имеют различные подтипы. Заметным исключением является узловая меланома (см. рисунок 3, этап 8), которая не связана с каким-либо предшествующим поражением (более подробно об этом будет рассказано ниже).

Образование инвазивной меланомы. Как только меланома становится инвазивной, её главными особенностями, обеспечивающими прогрессирование становятся драйверные мутации, активирующие путь MAPK, а также мутации TERT, которые накапливаются на более ранних стадиях прогрессирования. Но в тоже время инвазивные меланомы демонстрируют высокую частоту биаллельной инактивации CDKN2A, которая не наблюдается в поражениях-предшественниках30. В исследованиях с помощью иммуногистохимии было выявлено негативное окрашивание для белка p16INK4A, кодируемого локусом CDKN2A, и данный результат коррелирует с наличием инвазивной меланомы у пациентов117–119. На животной модели NrasQ61K Cdkn2aINK4-/- трансгенных мышей также развивалась инвазивная меланома с низкой латентностью и высокой пенетрантностью120. Суммируя эти данные можно предполагать, что INK4A является важным барьером, блокирующим переход к инвазивной меланоме. Но есть случаи, когда в инвазивных меланомах сохраняется

Cancer Chameleon

p16INK4A, что может указывать на существование альтернативных путей прогрессирования, которые, скорее всего, связаны с G1/S контрольной точкой.

Помимо генетических изменений CDKN2A, мутации компонентов комплекса ремоделирования хроматина SWI/SNF (SWI/SNF), в частности ARID2 и ARID1A, возникают при переходе к инвазивной меланоме30. SWI/SNF действует как опухолевый супрессор для многих видов опухолей121, включая меланому7, но лежащие в основе его работы механизмы все еще остаются неясными122. Было высказано предположение, что SWI/SNF поддерживает целостность генома122,123, что примечательно, поскольку появление мутаций SWI/SNF во время прогрессирования меланомы совпадает с появлением широко распространенных хромосомных аберраций30, которые обычно наблюдаются в полностью сформированных меланомах3.

Существует субпопуляция меланом, которая, по-видимому, возникает без поражений-предшественников (см. рисунок 3, этап 8). Возможно она подавляет морфологические проявление своего развития, ввиду чего субпопуляция не обнаруживается и появляется внезапно в виде узловых разрастаний без видимых предшественников. Предыдущие исследования не выявили значительных различий в спектре мутаций, активирующих путь MAPK, между этими узловыми меланомами и другими подтипами меланом3. Если исходить из предпосылки, что образование меланомы требует возникновения множественных независимых мутаций, узловые меланомы могут возникать либо в результате быстрого накопления мутаций, либо, что более вероятно, из меланоцита (см. рисунок 3, этап 7), который имеет вторичные и даже третичные генетические изменения, за которыми следует мутация, инициирующая пролиферацию, которая, как наиболее вероятно, активирует путь

MAPK124.

Мутационные процессы, формирующие геномный ландшафт меланом, начинают меняться, как только меланома становится инвазивной (рисунок 4). Но, видимо это не ведет к существенному увеличению количества точечных мутаций в инвазивной части меланомы по сравнению с ее неинвазивной частью30. Это согласуется с тем, что УФ-излучение является основным фактором, вызывающим изменения на уровне последовательности ДНК. Как только клетки проникают глубже в кожу, они становятся менее доступными для мутагенного воздействия УФ-излучения. Напротив, количество числа альтераций увеличивается при переходе от меланомы in situ в инвазивную меланому125,126. Это указывает на то, что другие мутационные процессы начинают вносить вклад в формирование развивающегося генома меланомы.

Мутации на поздних стадиях первичной меланомы. Мутации TP53 определяются примерно в 20% метастатических меланом7,10. Исследования мутаций TP53 в первичных меланомах выявили низкую частоту мутаций, чем при метастазах меланом127–129, что указывает на возможное более позднее возникновений мутаций во время развития первичных меланом130–133. Точно так же мутации PTEN, вероятно, возникают позже при первичных меланомах. В исследованиях мутации PTEN чаще встречались в толстых первичных меланомах и метастазах опухоли134,135. Важное предостережение заключается в том, что эти исследования могли занижать частоту мутаций в более тонких первичных меланомах из-за попадания в них стромальных клеток. Тем не менее для PTEN исследования ИГХ также показали, что потеря белка сильно коррелирует с глубиной инвазии и риском метастазирования136,137.

Cancer Chameleon

Таким образом, эти данные предварительно рассматривают двухаллельную потерю CDKN2A как событие ранней стадии инвазии первичных меланом, тогда как мутации TP53 и PTEN возникают на более поздних стадиях прогрессирования, но для определения времени TP53 и PTEN потребуется дальнейший генетический анализ. На животных моделях BRAFV600E совместно с потерей функции p53 формирует меланому у мышей138 и рыб34, а совместно с потерей PTEN приводит к формированию меланомы у мышей139. Высокая пенетрантность и низкая латентность в этих животных моделях предполагает, что дополнительных генетических изменений для прогрессирования меланомы в подобных условиях не требуется. Напротив, в меланомах человека инактивация CDKN2A и активация теломеразы, по-видимому, являются дополнительными отобранными генетическими изменениями, которые происходят до изменений, которые влияют на TP53 и PTEN.

Метастатическая меланома

Формирование метастазов меланомы. Меланомы называются метастатическими, если их клетки распространились за пределы локального участка первичной опухоли и заселили другие ткани. Подобно многим солидным опухолям, метастазы меланомы обычно сначала появляются в лимфатических узлах дренирующей области первичной опухоли, тогда как отдаленные метастазы, вовлекающие висцеральные участки, обычно появляются позже.

Это привело к предположению, что метастатическое распространение последовательно прогрессирует от первичной опухоли к региональному метастазированию и, наконец, к формированию отдаленных метастазов. Именно поэтому проводится исследование сигнальных лимфоузлов, а также есть исследования, связанные с превентивным удалением регионарных лимфоузлов140. Ряд работ предполагают параллельное развитие метастазов, а не их последовательное прогрессирование (рисунок 5). Во-первых, у пациентов, перенесших резекцию сигнальных лимфатических узлов, не было увеличения продолжительности жизни, чего можно было бы ожидать, если бы болезнь была регионально ограничена в определенный момент метастатической диссеминации141,142. Во-вторых, циркулирующие опухолевые клетки обнаруживаются у пациентов с регионарными метастазами и даже без метастазов143,144. Это указывает на то, что региональные узлы могут не отражать границы диссеминации, а их вовлечение служит маркером метастатической диссеминации, как это было показано для других видов рака, таких как карцинома молочной железы и эндометрия145–148. Наконец, филогенетический анализ совпадающих первичных и метастатических поражений выявил паттерны параллельного распространения у большинства исследованных пациентов149. Это исследование также показало, что метастазы меланомы могут идти от множества клеток либо одновременно, либо, что более вероятно, последовательным путем в течение определенного периода времени. Мы предполагаем, что последний сценарий более точно объясняет появление регионарных метастазов. Из-за их прямого соединения с первичной опухолью через лимфатические сосуды, циркулирующие опухолевые клетки имеют довольно высокую вероятность развития опухоли по сравнению с дистантными участками, где метастаз менее вероятен.

Есть свидетельства того, что даже клетки из предшественников меланомы способны к диссеминации и ограниченной колонизации (рисунок 5). Так небольшие скопления меланоцитов были обнаружены в лимфатических узлах, удаленных у пациентов, не

Cancer Chameleon

одновременно распространяются в разные части организма, как расположенные рядом с опухолью, так и на большом расстояние от неё. Первые метастазы появляются в локальных лимфатических узлах, благодаря их прямой связи с первичной меланомой лимфатическими сосудами. В результате этого возможно образование большого числа узловых метастазов. При этом циркулирующие опухолевые клетки обеспечивают формирование отдаленных метастазов. б) Небольшая часть метастазов обнаруживается без видимой первичной опухоли. Эволюция этих неизвестных первичных меланом плохо изучена, но мы предполагаем, что некоторые из них могут представлять собой первичные меланомы, возникшие из клеток, источником которых были доброкачественные предшественники, такие как невус, и уже затем, они приобрели свои вторичные и третичные онкогенные изменения после попадания в другие ткани.

Мы предполагаем, что субпопуляция ММБПО происходит из меланоцитов, которые метастазировали из невусов (рисунок 5). В этой модели меланома приобрела бы дополнительные мутации, необходимые для полной трансформации в месте метастазирования, и, таким образом, она могла бы быть больше похожа на первичные меланомы, чем на метастазы меланомы. В соответствии с этим сценарием клинически ММБПО имеют значительно лучший прогноз, чем истинные метастатические меланомы на аналогичных участках поражения160. Эта модель нуждается в дальнейшем тестировании; однако существующие данные свидетельствуют о том, что метастатическая диссеминация при меланоцитарной неоплазии может происходить на ранней стадии, даже до образования меланомы, причем образование клинически обнаруженных метастазов зависит от дополнительных генетических изменений (рисунок 5).

Неизвестно, способствуют ли определенные драйверные мутации отходу от первичной меланомы и/или колонизации нового участка во время метастатической диссеминации. Анализ когорт совпадающих первичных вариантов и метастазов путем секвенирования экзома не выявил повторяющихся драйверных мутаций, которые ограничены метастазами149,162-165. Однако ряд генетических признаков предполагает активацию передачи сигналов WNT через активирующие мутации β-катенина, поскольку эти мутации были идентифицированы в отдельных метастазах пациентов, и их можно было проследить до субпопуляций первичной опухоли149. Активация передачи сигналов WNT также способствует метастазированию в мышиной модели меланомы166. Хотя могут быть случаи, когда патогенные мутации способствуют метастатическому распространению, окончательный паттерн повторяющихся изменений, связанных с метастатическим прогрессированием, еще не выявлен.

Жизнь метастаза меланомы. Метастазы меланомы, как правило, имеют самый высокий индекс пролиферации 167. Генетическая гетерогенность метастазов меланомы, как ожидается, должна быть ниже, чем у первичной меланомы, потому что ее популяционное разнообразие снижается во время клональной экспансии небольшого числа клеток-основателей. Тем не менее в метастазах обнаруживаются субклоны149. Мутации, которые придают устойчивость к таргетным методам лечения, которые направлены против мутантных белков BRAF-V600E, также могут приводить к одновременному появлению устойчивых клонов в других метастазах168. Этот тип рецидива может возникнуть в течение нескольких месяцев после первоначального терапевтического ответа, вполне вероятно, что клетки, несущие мутации

Cancer Chameleon

резистентности, были всего лишь малыми субклонами на тот момент. Вместе эти наблюдения поддерживают модель, в которой метастазы способны повторно заселять одни и те же места (рисунок 5). Эта модель подтверждена на мышиной модели меланомы169 и в филогенетических исследованиях рака простаты человека170.

Выводы

Существуют различные подтипы меланомы, которые различаются по клеточному происхождению, анатомическому расположению, роли УФ-излучения как патогенного фактора, типу соматических мутаций и типу предшественника поражения. Двумя наиболее распространенными типами меланомы у европейцев являются ХПС-меланома и неХПС-меланома. Наиболее частая инициирующая мутация в неХПС-меланомах — это BRAFV600E. В отсутствие других мутаций драйверная мутация BRAFV600E приводит к ограниченному разрастанию меланоцитов с образованием обычного невуса. Эти невусы представляют собой стабильные клеточные образования, которые, вероятно, состоят из смеси стареющих клеток и медленно пролиферирующих клеток, которые регрессируют благодаря иммунным клеткам. Редко они прогрессируют до меланомы за счет приобретения вторичных и третичных мутаций, таких как мутации промотора TERT и биаллельной потери CDKN2A. Напротив, ХПС-меланомы имеют другой набор мутаций-драйверов, таких как мутации NRAS, NF1 или BRAFnonV600E. Обычно они возникают не из обычных невусов, а из меланомы in situ или промежуточных поражений.

Активация пути MAPK, вероятно, необходима для образования клинически заметного меланоцитарного новообразования. Только конститутивная активация этого пути лишь частично трансформирует меланоциты, поскольку для полной трансформации необходимы дополнительные изменения. Активация теломеразы TERT мутациями в промоторной области — это обычное раннее событие в развитии первичных меланом. Для образования меланомы требуются мутации с наиболее выраженным влиянием на контрольную точку G1/S. Раньше всех появляются мутации, способствующие распространению меланомы, однако наследственные или соматически приобретенные мутации, которые отключают барьеры на более поздних стадиях трансформации, таких как TERT или CDKN2A, могут существовать в меланоцитах заранее, и в этом случае опухоль может перейти на следующую гистопатологическую стадию после мутации вызывающей пролиферацию. Появляются доказательства того, что существует промежуточная стадия меланоцитарной неоплазии - меланоцитарные новообразования с неясным потенциалом злокачественности, при которой опухолевые клетки несут более одной драйверной мутации, но меньше, чем требуется для полной трансформации.

УФ-излучение является ключевым мутагеном, действующим на все стадии развития меланомы до перехода в инвазивную меланому, когда преобладают другие мутагенные механизмы, такие как хромосомная нестабильность. Поскольку УФ-излучение больше не может действовать как мутаген на инвазивную опухоль, возможен положительный отбор генетических изменений, которые увеличивают хромосомную нестабильность.

Дальнейшее улучшение понимания генетической эволюции меланом от клетки-основателя через различные типы предшественников даёт возможность улучшить диагностику, создать новые методы раннего распознавания поражений с повышенным риском прогрессирования и проводить выборочные вмешательства на ранних стадиях. «Золотым стандартом» для оценки злокачественного потенциала