10 Выявление возбудителей иммуноферментным методом

-срезы депарафинировать в ксилоле с последующим помещением в химически чистый ацетон

-обработать перекисью водорода(1,5-25 раствор пергидроля)

-нанести указанную сыворотку(в разведении,указанном в инструкции к ней),содерджащую антитела к возюбудителю,инкубировать в термостате при 37 град С в течение 45 мин

-нанести антивидовую сыворотку,меченную пероксидазой(в разведении,указанном в

инструкции к сыворотке),инкубировать во влажной камере при 37 град С 45 мин

-промыть фосфатным буфером дважды по 10 мин

-обработать раствором диаминобензидина-ДАБ(5 мг на 10 мл 0,1 М трис-буфера с добавлением 3-4 капель 0,2% пергидроля) на 4 мин

-промыть фосфатным буфером быстро

-обработать 0,1% раствором четырехокиси осмия для более четкого контрастирования 3-4 мин

-промыть физраствором,затем дистиллированной водой

-окрасить гематоксилином или при необходимости другим ядерным красителем,заключить в бальзам

РЕЗУЛЬТАТЫ:возбудитель-коричневый разной степени интенсивности,фон-синеватый

11 Выявление возбудителей с помощью люминесцентной микроскопии

Лучше исследовать мазки-отпечатки,а еще лучше-соскобы из поверхности органа,предварительно высушенные чистой тряпкой(больше клеток,чем при отпечатке)-при ОРВИ.При бактериальных инфекциях лучше взятие отпечатков или исследование срезов.

Ход исследования:

-сухую люминесцентную сыворотку растворить в объеме согласно инструкции на ампуле дистиллированной водой

-желательно сыворотку отцентрифугировавть при 3-6 тыс оборотах в мин-30 мин.Разведенную сыворотку можно длительное время хранить в пробирке с резиновой пробкой при температуре 4-10 градС

-непосредственно перед нанесением ее необходимо развести 0,15 М хлористым натрием(рН 7,2-7,4),рабочие разведения готовят рядом двухкратных разведений

-на срез наносится несколько капель сыворотки(окраска производится во влажной камере-чашке Петри,на дно которой наносится увлажненная фильтровальная бумага

-15-30 мин при комнатной температуре

-промыть мазок в 0,15 М хлористом натрии дважды по 10 мин

-мазок подсушить на воздухе

Мазки просматриваются под водной или масляной иммерсией используя специальное нефлюоресцирующее масло или его заменитель,например,диметилфталат.

РЕЗУЛЬТАТЫ:фон темный,некротические клетки и ткани-темно-желтые,участки,содержащие антиген-темно-зеленые.

Применение тканей,залитых в парафин,дает неспецифическую флюоресценцию.Поэтому необходима специальная заливка тканей по методике Санта-Мари.

Заливка в парафин по Санта-Мари:

-фиксация кусочков толщиной до 5 мм в 96% этаноле,охлажденном до 4 град С(50 мл на 1 кус) в закрытом сосуде 1 час при 4 град

-подрезание ткани до толщины 2-4 мм

-продолжение фиксации при 4 град С 15-24 часа

-абсолютный этанол при 4 град С 1-2 часа(четырежды)

-ксилол при 4 град С 1-2 часа-трижды,после чего оставить материал при комнатной температуре

-парафин при 56 град С по 1-2 часа(четырежды)

-резка обычнм способом только флотация на поверпхности воды при 40 град С и кратковременнная.Срезы высушить при 37 град 30 мин(срезы можно хранить при 2 град

С до нескольких недель

-депарафинирование в холодном ксилоле при 4 град С по 10-15 сек(дважды)

-удаление ксилола осторожным движением вверх-вниз в 96 % этаноле при 4 град С по 10-15 сек(трижды)

-удаление спирта в буферном растворе при 4 град С по 1 мин-трижды

-обработка флюоресцентной сывороткой.

ВСЕ МЕТОДЫ ПРОВЕРИТЬ!