8 Методы выявления нв антигена

8а Окраска орсеином.

Данная окраска имеет наибольшее значение для диагностики гепатита В

Окраска по Шиката.

-срез поместить в 1-й раствор(9,5 мл 5%-го марганцовокислого калия+5 мл 3%-го раствора серной кислоты+85 мл дистиллировавнной воды)-на 10 мин

-поместить в 2% щавелевую кислоту на 10 мин

-промыть в проточной воде 5 мин,затем в двух порциях дистиллированной воды и двух порциях 70%-го этанола

-на срез налить краситель(орсеин 4 г,70% этанол-100 мл,концентрированной соляной кислоты-2 мл)-на 4 часа

-промыть в проточной воде 10 мин

-дифференцировать солянокислым этанолом

-заключить в бальзам

РЕЗУЛЬТАТ:в цитоплазме гепатоцитов на светло-коричневом фоне тканевых элементов выявляются крупные округлые темно-коричневые включения однородного строения.Аналогично окрашиваются ядра лимфоцитов в перипортальных инфильтратах

Эластические волокна,медно-белковые комплексы окрашиваются также в коричневый цвет.

Рез-ты во многом определяются качеством красителя.Встречаются реактивы,не окрашивающие специфический субстрат.Поэтому при смере реактива необходимо апробировать его на материале,где уже был получен положительный результат.

Редко реактив пригоден более 2 недель,поэтому нужен свежий.Но все же встречаются орсеины,окрашивающие цитоплазму гепатоцитов диффузно,особенно на секционном материале.Поэтому предложены другие методы.

8Б Окраска резорцин-фуксином(по Сенба,1982 г):

( А.С.Логинов, Аруин Л.И.Клиническая морфология печени.М.,Медицина,1985 г,с.12)

1.Фиксация в 10% формалине,заливка в парафин

2.Обработка депарафинированных срезов течение 10 мин в смеси,содержащей из 5% перманганата калия(9,5 мл),3% серной кислоты(5 мл),дистиллированной воды до 100 мл

3.Обесцвечивание срезов в течение 10 мин в 2% щавелевой кислоте

4.Промывка в проточной воде

5.Сенсибилизация(в 2% железо-аммонийных квасцах или в 1% нитрате уранила)

6.Помещение срезов на 1-3 часа в раствор резорцин-фуксина.

Приготовление раствора:

К 200 мл 1% раствора основного фуксина добавляют 5 г резорцина.Раствор кипятят в широкой чашке(диаметром 25 см) при постоянном перемешивании примерно 30 мин

(пока объем не уменьшится вдвое),затем добавляют 25 мл 29% раствора хлорида железа

и кипятят еще 5 мин.Охлажденный раствор фильтруют и осадок промывают на том же фильтре дистиллированной водой до тех пор,пока вода не перестанет окрашиваться.

Осадок вместе с фильтром заливают 200 мл абсолютного спирта и кипятят в водяной бане 2-5 мин,восстанавливают объем испарившегося абсолютного спирта(до 200 мл)

и добавляют 4 мл НС1.Дифференцируют окрашенные срезы абсолютным спиртом,

затем 1% солянокислым спиртом 5 мин.После этого промыввают в воде,обезвоживают

и заключают в бальзам.

РЕЗУЛЬТАТЫ:НВ антиген,эластические волокна,желчные пигменты темно-синие или черные.

8В Высокоспецифичный метод для выявления нв антигена по( ,1982 г).

1.Депарафинированные и доведенные до воды срезы обрабатывают метанолом,содержащим 0,6% перекиси водорода,в течение 20 мин для подавления эндогенной пероксидазы.

2.Промывают в трех сменах фосфатного буфера(рН 7,2)

3.Инкубируют в растворе пероксидазы(5 мг на 100 мл),нанесенном на срезы,в течение

30 мин при комнатной температуре во влажной камере

4.Промывают в буфере

5.Обрабатывают диаминобензидином

6.Промывают в буфере

7.Докрашивают ядра гематоксилином Майера

РЕЗУЛЬТАТЫ:включения НВ антигена темно-коричневого цвета