Центромера — это участок хромосомы, который соединяет собой сестринские хроматиды (см. рис. 6), но главное даже не это. Центромера является местом прикрепления белков, связывающих хромосомы и веретено клеточного деления, тем самым обеспечивая расхождение хроматид во время деления клеток. Это необходимо для распределения генетического материала по дочерним клеткам.
Сателлитные последовательности имеют важное клиническое значение. Опухолевый процесс в ряде случаев сопровождается возникновением так называемой микросателлитной нестабильности, когда в сателлитных участках возникает бесчисленное множество мутаций. Такое бывает при наличии дефектов в системе репарации, и данный феномен является предиктором высокой иммуногенности опухоли (продукции опухолью множества антигенов, способных индуцировать иммунный ответ), а также эффективности иммунотерапии — специфического варианта лекарственного лечения опухолевых заболеваний, который реализуется путем ингибирования контрольных точек иммунного ответа и помогает клеткам иммунной системы (Т-киллерам, натуральным киллерам, макрофагам) уничтожать опухолевые клетки. Положительная предиктивная роль микросателлитной нестабильности в отношении эффекта иммунотерапии продемонстрирована во множестве исследований и обзоров [15].
Оставляю тебя с этой информацией, и как только ты вернешься, мы продолжим постигать азы биохимии.
Белки хроматина
Топоизомеразы
ДНК в ходе репликации может подвергаться сверхспирализации. Этот вариант сворачивания ДНК не позволяет считать с нее что-либо. В состоянии сверхспирализации молекула ДНК наиболее стабильна в энергетическом отношении. То есть она приобретает такую конформацию, которая требует минимального (насколько это возможно) количества энергии. Это не ее причуда: данный феномен имеет термодинамическое обоснование.
Чтобы считать с нее информацию или продолжить репликацию, эту суперспираль нужно распаковать, причем это одинаково важно как в прокариотических (бактериях), так и в эукариотических клетках. Для этого есть ферменты, получившие название топоизомераз (рис. 7), которые различаются у прокариот и эукариот. Без топоизомераз клетка не может экспрессировать гены, что приводит к ее смерти
[3].
Рисунок 7 | Сверхспирализация ДНК в ходе репликации и функция топоизомераз
Как ясно из рис. 7, топоизомеразы нужны для того, чтобы молекула ДНК не превратилась в непонятную кашу, информацию с которой невозможно считать. К концу статьи ты также узнаешь, как и почему топоизомераза стала мишенью для ряда очень важных фармакологических препаратов.
Гистоны и современные представления о пространственной организации хроматина в клетке
Гистоны выводят ДНК на новый уровень, накручивая ее на себя самым причудливым образом. В этом участвует несколько фракций гистоновых белков (Н1, Н2А, Н2В, Н3, Н4). Гистоны глубоко консервативны, то есть их структура идентична гистонам более простых организмов, что для меня (убедительный уровень аргументации, правда?)
подчеркивает высокое биологическое значение этих белков [1, 3, 8]. Однако как именно гистоны укладывают ДНК в более компактную структуру, которая не мешает клетке выполнять ее функции, не вполне ясно и сейчас.
Что касается третичной структуры ДНК, на сегодняшний день наши представления довольно размыты. Во многих учебниках биологии и биохимии (преимущественно русскоязычных) отражена иерархическая модель укладки ДНК. Согласно этой модели, ДНК-нуклеосомы размером 11 нанометров складываются в 30 нанометров, а затем в волокна размером от 120 до 700 нм.
Проблема в том, что данная модель была продемонстрирована в условиях in vitro. То есть из клетки были удалены другие компоненты, применялись детергенты и растворы с очень высоким содержанием солей. Поэтому вопрос, как же на самом деле уложен хроматин в клетке, долгое время оставался открытым.
Пролить свет на этот вопрос получилось у группы исследователей с помощью особого метода визуализации — ChromEMT [14]. Исследователи применили осмиофильный полимер, который позволил избирательно увеличить контрастность хроматина и лучше рассмотреть его пространственную организацию при помощи электронного микроскопа.
С помощью этой методики исследователям удалось выяснить, что диаметр хроматина в разных фазах клеточного цикла колеблется от 5 до 24 нм и что сам хроматин представляет собой неупорядоченную цепь с различными диаметрами (от 5 до 24 нм) с множеством вариантов расположений нуклеосомных частиц, бесчисленным количеством структурных конформаций и способностью изгибаться в различных плоскостях для достижения компактной ориентации в ядре. Для того, чтобы укомплектовать хроматин в ядре, не нужно формировать из него дискретные волокна более высокого порядка (в 30, 300 нм и т. д.), как считалось ранее. Нуклеосомные частицы диаметром 30 и более нм в различных фазах клеточного цикла найти просто
не удалось [13]. Ниже прикреплена иллюстрация, изображающая трехмерную структуру генома в клеточном ядре (рис. 8, 9).
Рисунок 8 и 9 | Укладка хроматина в ядре. Данные полученные методом визуализации ChromEMT.
В целом функция гистонов сводится к компактному упаковыванию ДНК, а также к регуляции процессов считывания ДНК: репликации и транскрипции.
Структура гистонов изменяется при действии на них различных транскрипционных факторов. Эти факторы химически модифицируют N-конец гистона (путем ацетилирования, фосфорилирования, деацетилирования, метилирования), что ведет к изменению конформации гистоновых белков в целом. В ряде случаев это приводит к увеличению доступности соответствующих генов для процессов транскрипции. В виде упрощенной схемы это выглядит так (рис. 10):
Рисунок 10 | Химическая модификация гистонов, лежащая в основе эпигенетической регуляции транскрипции генов
Метаболизм ДНК. Репликация
Мы подошли к самому сложному и интересному. Проследим цепь событий. У нас есть клетка, которая живет своей жизнью и которой, в общем-то, все равно, что происходит вокруг нее: она выполняет свою функцию, перебрасываясь с другими клетками цитокинами и метаболитами, и меряется с ними размерами своих цитоподий. Внезапно она получает «пинок» — молекулярный сигнал от старшего товарища по ткани в виде паракринных факторов роста (например, EGF — эпидермальный фактор роста; IGF-1 — инсулиноподобный фактор роста 1 и др.) или ловит своим рецептором гормон (например, эстрадиол). При воздействии на клетку вышеуказанных молекул она понимает только одно: ей приказано делиться. Химический сигнал, словно бестактное восклицание соседки: «А когда замуж?», выводит клетку из состояния покоя, когда воздействует на ее рецепторы к факторам роста. Серия реакций внутри клетки приводит к тому, что гистоны (после ацетилирования) всеми фракциями отсоединяются от ДНК, делая ее доступной для репликации, и, неожиданно, словно твое отчисление из вуза, наступают пресинтетическая и синтетическая фазы клеточного цикла. Теперь перед нами — обнаженная ДНК в виде двойной спирали, из которой нужно сделать таких две. На первый взгляд миссия более чем невыполнимая, но, как и везде, нужно
подходить к этому процессу последовательно. Предлагаю не тянуть с этим.
В главных ролях:
ДНК-полимераза; ДНК-хеликаза; ДНК-топоизомеразы; ДНК-праймаза; ДНК-гираза; ДНК-связывающие белки.
Во второстепенных ролях:
Факторы, инициирующие транскрипцию ДНК (их великое множество); Белки клеточного цикла (о которых мы поговорим позднее).
Этапы репликации ДНК:
1.инициация;
2.элонгация;
3.терминация.
Инициация
Уже известный нам белок, ДНК-хеликаза, присоединяется к точке инициации на молекуле ДНК. Эта точка характеризуется множеством ТА-пар в структуре и является сайтом связывания репликативного комплекса. Это связывание возможно после предварительной денатурации данного участка ДНК. Далее хеликаза движется от 5' к 3'- концу, раскручивая ДНК по мере продвижения. Параллельно действуют не только ДНКсвязывающие белки, удерживающие разъединяющиеся цепи ДНК от необдуманных поступков, но и уже известные топоизомеразы (ДНК-гираза или ДНК-топоизомераза 2), которые снимают топологическое напряжение (стремление к спирализации и замыканию в себе) с цепей ДНК (рис. 11) [1, 3, 6, 8].
Рисунок 11 | Процесс расплетания двойной спирали ДНК с помощью ДНК-хеликаз и ДНК-связывающих белков
ДНК-полимераза не спешит работать. Она до последнего будет тянуть с синтезом нуклеиновой кислоты. Связано ли это с ее тенденцией к созидательному созерцанию или с ее природным высокомерием, но она возьмется за работу только после того, как будет установлен праймер. Праймер — это своеобразная РНК-затравка, фрагмент РНК, синтезированный РНК-праймазами. Он нужен для того, чтобы ДНК-полимеразе было что удлинять, ибо главная причина ее долгого включения в работу — неспособность синтезировать РНК-фрагмент de novo, то есть с нуля. Она может лишь удлинять имеющийся фрагмент. С формированием праймеров связан переход фазы инициации в фазу элонгации (удлинения) цепи.
Элонгация
ДНК-хеликаза связывается с РНК-праймазой, и это взаимодействие обусловливает синтез лидирующей цепи ДНК (рис. 12) [3].
Рисунок 12 | Фаза элонгации
Синтез лидирующей цепи осуществляет ДНК-полимераза 3. Синтез на данной цепи осуществляется непрерывно, путем простого присоединения дезоксирибонуклеотидов к 3'-концу предыдущего нуклеотида. Это называется синтезом от 5' к 3'-концу.
Но события разворачиваются так, что ДНК-полимераза 3 работает на два фронта и синтезирует также и отстающую цепь. ДНК-полимераза способна работать только в направлении от 5' к 3'-концу. Отстающая цепь характеризуется противоположным направлением нуклеотидов, и, если бы ее синтез тоже был непрерывным, репликативная вилка бы полностью распалась. А вот РНК-праймаза может синтезировать цепи в направлении 3'-5'. Она делает небольшой фрагмент, который затем просто удлиняется ДНК-полимеразой. Такие кусочки называются фрагментами Оказаки. РНК-участок потом вырезается эндонуклеазой и РНК-азой. Но что самое шокирующее: синтез происходит одновременно и скоординированно. А ты жалуешься, что тебе трудно совмещать учебу с работой!
Секрет успешной работы ДНК-полимеразы 3 прост: на отстающей цепи также работает комплекс ДНК-хеликазы и ДНК-праймазы. Все вместе это можно назвать праймосомой. Далее фрагменты Оказаки сшиваются ДНК-лигазой [1, 3].
Получилось много текста, поэтому резюмирую:
Для начала репликации нужно найти сайт связывания репликативного комплекса.
ДНК-хеликаза необходима для разъединения цепей, иначе считать их невозможно.
ДНК-праймаза и ДНК-полимераза необходимы для синтеза и удлинения нуклеиновой кислоты (ДНК), а ДНК-топоизомераза и ДНКсвязывающие белки — для того, чтобы цепи ДНК не приняли «нечитаемую» конформацию.
Одна дочерняя цепь синтезируется непрерывно, другая — прерывисто с помощью фрагментов Оказаки.
Нюансы и интересные факты
*Теломеры и теломеразы. В ДНК есть также концевые фрагменты, состоящие из множества повторяющихся пар нуклеотидов и не несущие существенной смысловой нагрузки. Эти фрагменты несут название теломеров (см. рис. 6).
В ходе репликации эти концевые теломеры не воспроизводятся полностью, и с каждым делением клетки теломеры постепенно укорачиваются на 5–6 пар нуклеотидов. В контексте данного вопроса выделяют такое понятие, как лимит Хейфлика — число делений, при которых еще есть чему укорачиваться. В среднем после 50–52 делений клетки теломеры укорачиваются до такой степени, что репликация в определенный момент становится невозможной, и клетка останавливается в G0-фазе (фаза покоя) клеточного цикла или запускает программу апоптотической гибели. Выходит, что по достижении данного лимита становится невозможной регенерация клеток и тканей организма. Считается, что это один из ведущих факторов, обусловливающих старение организма и конечность нашего существования (об этом говорит эпигенетическая теория старения). В этом есть свой биологический смысл, ведь при большом количестве делений происходит накопление структурных нарушений в ДНК — мутаций, которые способны стать причиной развития опухолевых заболеваний.
Однако существуют клетки (например, эмбриональные, половые и опухолевые), в которых есть теломераза — фермент, который достраивает теломеры в ДНК [2, 3]. Такое достраивание теломер делает опухолевые клетки бессмертными, поскольку возможное количество делений клеток при наличии теломеразы становится практически неограниченным.
*Топоизомеразы и мишени для фармакологических препаратов. В
бактериальных клетках, как и в эукариотических, после репликации хромосомы принимают конформацию, которая наиболее выгодна в термодинамическом отношении (требует минимального количества энергии для ее поддержания), но не выгодна в отношении жизнедеятельности клетки. Что это значит? По окончании репликации цепи ДНК переплетены между собой таким образом, что транскрипция (образование мРНК в результате считывания генетической информации с ДНК) невозможна: ферментам, обеспечивающим процесс транскрипции, просто не подобраться к необходимому участку ДНК, поскольку она упакована для этого самым неподходящим образом, в виде
конгломерата. Этот конгломерат цепей не распутать без участия ДНК-топоизомеразы IV (топоизомеразы II типа). Они вносят кратковременный разрыв в обе цепи ДНК, и одна из цепей ДНК может пройти через этот разрыв (рис. 7) [3].
* Топоизомераза IV является важной лекарственной мишенью для противомикробных препаратов широкого (очень) спектра действия — хинолонов и фторхинолонов. Препараты избирательны по отношению к топоизомеразе IV и не проявляют интереса к топоизомеразам эукариот, что делает их применение очень удобным (и подчас спасает жизни). Как ты понимаешь, если вновь образовавшиеся хромосомы похожи на сыр «косичка», адекватно считать с них информацию бактериальная клетка не может. И ей ничего не остается, как погибнуть. Несмотря на селективность данных препаратов, их нельзя назвать абсолютно безопасными, но об этом ты узнаешь чуть позже на фармакологии [3, 9].
Синтез РНК и полипептидов
Синтез РНК. Транскрипция
Синтез РНК в общих чертах напоминает репликацию ДНК с некоторыми нюансами:
РНК-полимераза самодостаточна: ей не нужен праймер для начала работы.
Субстратом для образования РНК являются рибонуклеотиды с аденином, гуанином, цитозином и урацилом (вместо тимина). Если при репликации копируется вся цепь ДНК, то в случае с
транскрипцией читается лишь определенный участок ДНК, а именно ген, кодирующий определенный полипептид.
Синтез РНК начинается после связывания РНК-полимеразного комплекса с промотором. Это участок ДНК, который сигнализирует: синтез данного полипептида нужно начать отсюда. Промотор богат ТАТА-последовательностями нуклеотидных пар, за что получил кличку
«ТАТА-бокс» [1, 3].
Даже стадии транскрипции такие же, как и стадии репликации: инициация, элонгация и терминация. Но опять же с некоторыми нюансами.
Инициация