1 курс / Биология / План-конспект лекции №5

Кариотип человека

Методы кариотипирования

Цитогенетический метод

Цели исследования кариотипа

Картирование генов

Генетические карты

Цитологические карты

Выделение ДНК

Получение и выделение определенных фрагментов ДНК

ДНК-зонды

Блот-гибридизация

Гибридизация in situ (или FISH-метод)

Клонирование ДНК в клетке

Клонирование без клеток хозяина – метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Секвенирование ДНК

Геномные библиотеки

Библиотека кДНК (комлементарной ДНК)

Геномная дактилоскопия

Методы генетического картирования наследственных заболеваний

Практическое значение исследования ДНК

В 70-80 годы 19 века Э. Страсбургер и растений и В. Флеминг у животных впервые описали митоз и особые окрашенные тельца, которые в 1883 году В. Вальдшер назвал хромосомами. Немецкий эмбриолог Т . Бовери установил, что число и форма хромосом видоспецифичны. В 1956 году шведские ученые Дж. Тио (Дж.Тийо) и А. Леван определили кариотип человека, включающий 46 хромосом.

Унифицированная классификация хромосом человека была утверждена на основании различий в длине хромосом и расположении центромеры в 1960 г в г. Денвере. По Денверской классификации выделяют метацентрические, субметацентрические и акроцентрические хромосомы. В кариотипе человека различают 7 групп хромосом, обозначаемых буквами латинского алфавита от A до G. В 1972 году была утверждена Парижская номенклатура хромосом человека, основанная на дифференциальном G-методе окрашивания. Этот метод предложил шведский ученый Т. Каспер в 1969 г. При дифференциальном окрашивании у каждой хромосомы появляется специфическая поперечная исчерченность в виде серий g-полос или Гимза- дисков, что расширяет возможность анализа кариотипа. Маркировка хромосом в виде g-полос позволяет идентифицировать их по характерным паттернам исчерченности. Такие g-полосы позволяют установить факты транслокаций. Существуют несколько методов дифференциальной окраски хромосом с использованием разных маркеров. По свечению Y-хроматина можно определить наличие Y-хромосомы в интерфазном ядре. В разных методах дифференциального окрашивания полосы могут не совпадать.

Это анализ кариотипа человека в делящихся соматических и половых клеток на стадии метафазы, реже – анафазы. Исследуют разные клетки человека в постнатальном периоде и клетки плода, выделенные из ворсин хориона, амниотической жидкости, пуповинной крови, плаценты.

Изучение кариотипа человека как вида , полиморфизм хромосом в разных популяциях, сравнительный анализ хромосом современного человека, его предков и обезьян; оценка мутагенности средовых. Определение хромосомного пола. Антенатальная и постнатальная диагностика хромосомных болезней. Исследование полового хроматина и экспресс-метод определения по половому хроматину хромосомного пола и хромосомных заболеваний, связанных с изменением числа половых хромосом.

Картирование - это методика определения положения гена в определенной хромосоме относительно других генов этой группы сцепления.

Это схема взаимного расположения генов в одной хромосоме. Генетическое картирование строится на анализе скрещиваний при сцепленном наследовании. С помощью гибридизации соматических были локализованы сотни человеческих генов. С этой целью получают гибриды соматических клеток человека и клеток животных и их анализируют. Одним из современных методов картирования генов человека является ДНК- гибридизация in situ. Для определения локуса гена получают и-РНК транскрибированную с этого гена, затем с помощью обратной транскриптазы ее кДНК-копию ( к ДНК- комплементарная ДНК). Проводят гибридизацию кДНК с денатурированной исследуемой хромосомной ДНК и по месту гибридизации определяют, где локализован определенный ген.

Дают информацию о расположении гена на основе прямого изучения наследственного материала и показывают реальное расположение генов на хромосоме и расстояние измеряют в п.н. Цитологические карты человека относят к мелкомасштабным физическим картам хромосом и строятся с использованием FISH- метода. Физические карты строят как для всего генома, так и для изолированной хромосомы. Кроме цитологических к физическим картам относят транскрипционные ( карты кДНК) макрорестрикционные карты контиг.

ДНК может быть выделена из любого биологического материала. Для научных исследований кроме выделения ДНК осуществляют химический синтез молекулы ДНК.

Осуществляется с помощью ферментов рестриктаз (рестрикционные эндонуклеазы) , которые разделяют молекулу ДНК на фрагменты. Выделяют более 500 типов рестриктаз бактериального происхождения, каждая из которых узнает свою специфическую последовательность ДНК (сайты рестрикции) и разрезает молекулу ДНК. Фрагменты ДНК могут быть разделены путем электрофореза в гене или пористом фильтре .

Разделенные фрагменты можно идентифицировать путем гибридизации с меченными ДНК-зондами.

Это одноцепочные ДНК, длиной до 30 нуклеотидов, которую используют для поиска комплементарных последовательностей . ДНК- зонды синтезируют или выделяют из генома. Клонируя эти последовательности, получают их в неограниченном количестве, нужном для исследования.

Это высокочувствительный метод идентификации последовательности ДНК. Наиболее часто используют Блот-гибридизация по Саузерну (Э. Саузерн – 1975г.). Метод используют для обнаружения перестроек и дупликаций в генах , для диагностики наследственных и онкологических заболеваний. Нозерн – блот - гибридизация ДНК-зондов с фрагментами м-РНК в геле, для определения экспрессии гена.

Это гибридизации с ДНК-зондами на гистологических или хромосомных препаратах FISH- метод. Препарат обрабатывают ДНК-зондами меченные флуорохромами. Места комплементарные ДНК-зонду видны в виде характерных светящихся точек.

Возможно использовать одновременно несколько разновидностей ДНК- зондов, меченных разными флуорохромами, в результате чего на препарате можно определить несколько искомых последовательностей.

Это метод выделения и идентификации фрагментов ДНК , а затем получение этих фрагментов ДНК в неограниченном количестве . Клоны ДНК, т.е. идентичных исходному фрагменту ДНК молекул получают в клетках бактерий или эукариот. Затем клонированная ДНК извлекается из клетки хозяина и используется.

Метод ПЦР разработан в 1986 г., в 1993г. за него была вручена Нобелевская премия. Это быстрый метод клонирования ДНК. Позволяет многократно воспроизвести (амплифицировать) ДНК, имеющейся даже в очень малом количестве in vitro.

Для проведения ПЦР необходимо знать нуклеотидную последовательность фрагментов ДНК.

Определение нуклеотидной последовательности ДНК осуществляется метом обрыва цепи. Одноцепочное ДНК, последовательность которой определяется, служит матрицей для синтеза серии комлементарных цепей, обрывающихся в момент присоединения к растущей цепи специфических нуклеотидов. В результате получают серию молекул ДНК, отличающихся по длине на 1 нуклеотид. Фрагменты разделяют в геле. В настоящее время процесс секвенирования автоматизирован.

Набор ДНК клонов одного источника называют библиотекой клонов, представляющих целый геном, одну хромосому или ряд генов. В геномной библиотеке должно быть по одной копии генов генома .

м-РНК используют для синтеза кДНК методом обратной транскрипции, кДНК затем клонируют. Библиотеки кДНК состоят только из экзонов.

В некодирующих областях генома человека имеются в огромном количестве однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП) или «снипы». Тандемные повторы состоят из различного количества мономеров. На хромосомах разного происхождения мини- и микроповторы отличаются по длине, что позволяет отличать хромосомы по характеру расположения полос минисателитных ДНК на электрофореграмме. Такая идентифецированность ДНК – отпечатков названа геномной дактилоскопией. Методика используется для идентификации людей , и для диагностики заболеваний.

До 1980-х годов открытие новых генов редкое событие. В настоящее время определение генов , ответственных за развитие моногенных наследственных болезней , значительно ускорено благодаря молекулярно-генетическим методам прямой и обратной генетики.

1)Прямая генетика: от белка к гену. 2) Обратная генетика: от гена к белку и от нормального гена к мутантному аллелю. Современное построение генетической карты генома человека проводится с помощью ~6000 полиморфных ДНК – маркеров. Позиционно-кондидантное картирование: выявление кодирующей последовательности (кДНК) в области хромосомной локализации гена с неизвестным биохимическим продуктом путем анализа генетических и транскрипционных карт.

Исследования ДНК используется для идентификации личности, подбора генетически близких доноров, выбора эмбрионов с нормальным геномом, для молекулярной генетической диагностики болезней человека, разработки новых лекарств, генной и клеточной терапии. Исследование геномов паразитов человека позволяет разработать молекулярно - генетический методы диагностики паразитарных заболеваний и подобрать лекарства. Геномные методы широко применяются в биотехнологии и создании трансгенных организмов.