10. Механизм и этапы окраски кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена.

Окраска по Цилю—Нильсену. Метод используется для выявления кислотоустойчивых микобактерий (возбудителей туберкулеза, микобактериозов, лепры), актиномицетов и некоторых других микроорганизмов. Кислотоустойчивость микроорганизмов обусловлена наличием в их клетках липидов, воска и оксикислот. Такие микроорганизмы плохо окрашиваются разведенными растворами красителей. Для облегчения проникновения красителя в клетки микроорганизмов нанесенный на препарат феноловый фуксин Циля подогревают над пламенем горелки.

Окрашенные микроорганизмы не обесцвечиваются слабыми растворами минеральных кислот и спирта.

Окраска микроорганизмов по методу Циля — Нильсена включает следующие этапы.

Фиксированный мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги и наливают на нее феноловый фуксин Циля (можно пользоваться фильтровальной бумагой, предварительно пропитанной красителем и высушенной). Мазок подогревают над пламенем горелки до появления паров, затем отводят в сторону для охлаждения и добавляют новую порцию красителя. Подогревание повторяют 2 — 3 раза. После охлаждения снимают фильтровальную бумагу и промывают препарат водой.

Препарат обесцвечивают путем погружения или нанесения на него 5%-го раствора серной кислоты (или 1%-м соляно-кислым спиртом) и промывают несколько раз водой.

Окрашивают препарат водно-спиртовым раствором метиле-нового синего 3 — 5 мин, промывают водой и высушивают.

При окраске по методу Циля—Нильсена кислотоустойчивые бактерии приобретают интенсивно красный цвет, остальная микрофлора окрашивается в светло-синий цвет.

Окрашивание спирохет и простейших традиционно ведется с применением особых красителей.

11. Капсула бактерий, ее назначение, методы выявления.

Клеточная стенка

Структура и строение:

Химический состав: пептидогликан (параллельными полисахаридными гликановыми цепями, состоящими из повторяющихся остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты). К ацителмурамовой кислоте присоединен тетрапепид (Ала-Глу-Лиз (ДАП)-Ала). У толстостенный с пептидогликаном связаны тейхоевые кислоты. У тонкостенных липопротеин, наружная мембрана.

Наружная мембрана является мозаичной структурой, представленной липополисахаридами (ЛПС), фосфолипидами и белками. Внутренний слой ее представлен фосфолипидами, а в наружном слое расположен ЛПС (липид А, ядро, полисахарид – О-антиген)

Функции: поддерживает форму и размер клетки, механически защищает клетку от действия вредных факторов внешней среды, участвует в процессе ее деления и транспорте метаболитов, является антигеном, участвует в адгезии (прилипании) – рецепторная функция.

Метод исследования: Немецкий ученый Грам изобрел метод выявления толщины клеточной стенки при обработке бактерий определенным сочетанием красителей. Толстостенные - грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет. Тонкостенные - грамотрицательные — в красный.

При нарушении синтеза клеточной стенки бактерий под действием различных ингибиторов образуются клетки с измененной формой:

• протопласты - бактерии, полностью лишенные клеточной стенки;

• сферопласты - бактерии с частично сохранившейся клеточной стенкой.

После удаления ингибитора клеточной стенки такие измененные бактерии могут реверсировать, т.е. приобретать полноценную клеточную стенку и восстанавливать исходную форму. Бактерии сферо- или протопластного типа, утратившие способность к синтезу пептидогликана под влиянием антибиотиков или других факторов и способные размножаться, называются L-формами (от названия института им. Д.Листера, где они были открыты).

Капсула - слизистая структура, прочно связанная с клеточной стенкой бактерий, имеющая четко очерченные внешние границы. Различают слизь, микрокапсулу и капсулу. Слизь - мукоидные экзополисахариды, не имеющие чётких границ, значение – участвует в процессе адгезии (прилипании). Микрокапсула - слизистое образование, выявляемое лишь при электронной микроскопии. Капсула по химическому составу: состоит из полисахаридов, не содержащих азота, полисахаридов, содержащих азот, из полипептидов.

Функции: образует более мощную оболочку бактерий, препятствует высыханию, препятствует фагоцитозу бактерий или может маскировать от фагоцитов, может быть запасным питательным веществом, является антигеном, участвует в адгезии.

Методы выявления капсулы: Плохо удерживают красители, поэтому применяют методы негативного контрастирования, например, по Бурри-Гинсу. тушь создает темный фон вокруг капсулы.