701

Различают острые и хронические биотесты. Первые рассчитаны на получение экспресс-информации о токсичности исследуемого вещества для данного тест-организма, вторые – на выявление долговременного эффекта действия токсикантов, в частности, их малых и ультрамалых концентраций. Острые опыты проводятся в различные сроки: от нескольких минут до 120 часов. В результате проведенных опытов учитывается величина выживаемости (или обратная ей величина смертности), т.е. статистически достоверный процент выживаемых или гибнущих особей за определенное время при определенной концентрации вещества. Острые опыты позволяют достаточно оперативно выяснить, оказывает ли данное вещество угнетающее, стимулирующее или иное действие на исследуемую тест-функцию у данного тестобъекта. В биотестировании важным условием является то, что исследования проводятся только на однородной культуре тест-организмов, которая адекватно реагирует на действие модельных токсикантов (Практическая…, 2016).

Объектами биотестирования могут быть химические соединения (при определении санитарно-токсикологических характеристик), вода природных водоемов, водопроводная и сточные воды, водные вытяжки из почв, отходов, различных изделий, кормов и др. (Практическая экотоксикология, 2016).

Разнообразие тест-организмов. В качестве тест-

организмов в биотестировании могут быть использованы либо целостные организмы (тест-организмы), либо изолированные органы, ткани (в биомедицинских исследованиях), эмбрионы (например, моллюсков), или клетки (например, половые клетки млекопитающих).

К настоящему времени для целей биотестирования используется большое разнообразие организмов из разных си-

10

стематических групп. Широкое распространение получили методы с использованием гидробионтов в качестве биотестеров. К распространенным группам организмов, используемых в биотестировании, относятся бактерии, цианобактерии, микроводоросли, высшие растения, простейшие (инфузории, жгутиконосцы), кишечнополостные (гидры), черви (планарии, пиявки), моллюски (пластинчатожаберные, брюхоногие), ракообразные (дафнии, артемии, гаммариусы, речные раки), скрыточелюстные (коллемболы), коловратки, насекомые, рыбы (гуппи, данио, осетровые), мелкие млекопитающие (грызуны).

В Р 52.24.741-2010 представлены экологические характеристики наиболее часто используемых в биотестировании гидробионтов (таблица 1).

Таблица 1

Экологическая характеристика организмов, используемых в биотестировании (Р 52.24.741-2010)

Окончание таблицы 1

Примечание. + обозначает наличие указанной экологической характеристики.

Рассмотрим основные экологические характеристики организмов используемых в биотестировании.

Ацидофилы – организмы – экстремофилы, обитающие в условиях высокой кислотности в отличие от базифилов, предпочитающих щелочную реакцию среды. Некоторые жгутиковые и коловратки могут развиваться в массовых количествах в сфагновых болотах при рН воды до 3,8 и при этом не встречаются в нейтральных и щелочных водоёмах. Типичными ацидофилами являются десмидиевые водоросли, обитающие преимущественно в болотах.

Базофилы (базофильные организмы, или алкалофилы,

или базифилы) – организмы – экстремофилы, нормально раз-

12

вивающиеся на щелочном субстрате, например, уробактерии, из высших растений белая акация, скумпия и другие.

Галофилы – организмы – экстремофилы, обитающие в условиях высокой солености (в морях, соленых озерах, засоленных почвах и т.д.). Они способны поддерживать более низкую концентрацию осмотически активных веществ в теле в сравнении с окружающей средой.

Гликофилы – организмы пресных водоемов и незасоленных почв.

Криофилы – организмы, обитающие в условиях устойчиво низких температур. К криофилам относятся многие обитатели полярных вод (иглокожие, рыбы, моллюски), холодных (главным образом горных) рек и ручьёв (форель, некоторые планарии и др.), а также многие наземные животные полярных широт и высокогорий. Большинство криофилов стенотермны.

Мезосапробы – полуанаэробные (альфа-мезосапробы) и анаэробные (бета-мезосапробы) организмы, обитающие в загрязненных органическим веществом водоемах.

Олигосапробы – организмы, обитающие в чистых или слабозагрязненных органическим веществом водах, содержащих избыток растворенного кислорода.

Термофилы – организмы, нормально существующие и размножающиеся при температуре выше 45°С (гибельной для большинства живых существ), например, некоторые рыбы, беспозвоночные (черви, насекомые, моллюски), микроорганизмы и растения. Обитают в горячих источниках, верхних слоях почвы, прогреваемых солнцем, в самонагревающихся субстратах (навоз, торф, зерно).

Нормативно-правовые документы, содержащие мето-

дики биотестирования. В своей работе аккредитованные ла-

13

боратории используют только нормативно-правовые документы: Санитарные Правила и Нормы (сокращенно СанПиН); методики выполнения измерений (МВИ), санитарные правила (СП); методические указания (МУ или МУК), гигиенические нормы (ГН), методические рекомендации (МР), рекомендации межгосударственной стандартизации (РМГ), методики измерений (МИ), рекомендации (Р), руководящий документ (РД) и другие обязательные и рекомендуемые к исполнению.

Для количественного химического анализа и оценки состояния объектов окружающей среды с целью государственного экологического контроля и мониторинга разрабатываются природоохранные нормативные документы федеративные (ПНД Ф). В методиках ПНД Ф с начальным номером 14 рассматривается количественный химический анализ вод; с номером 16 – методики анализа почвы, отходов, донных отложений и горных пород; с номером 13 – методики анализа атмосферного воздуха и промышленных выбросов (Перечень методик…).

Ведется федеральный реестр (ФР) методик Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии РФ (Росстандарта). Как правило, методики ПНД Ф вносят в ФР под соответствующим номером.

Международной организацией по стандартизации (ИСО) также зарегистрировано множество методик по биотестированию, в том числе:

– ИСО 11268-1-2012 Качество почвы – Определение токсичности с помощью земляных червей. Часть 1: Определение острой токсичности к Eisenia fetida или Eisenia andrei;

14

–ИСО 11268-2-2012 Качество почвы – Определение токсичности с помощью земляных червей. Часть 2: Влияние на размножение Eisenia fetida или Eisenia Andrei (ISO 11268- 2-2012 Soil quality – Effects of pollutants on earthworms. Part 2: Determination of effects on reproduction of Eisenia fetida/Eisenia Andrei);

–ISO 11268-3:2015 Soil quality – Effects of pollutants on earthworms - Part 3: Guidance on the determination of effects in field situations;

–ИСО 7346-1:1996. Качество воды. Определение острой летальной токсичности веществ в отношении пресноводных рыб. Часть 1: Статистический метод;

–ИСО 7346-2-1996 Качество воды – определение острой летальной токсичности веществ для пресноводной рыбы

(Brachydanio Rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)).

Часть 2: Полустатический метод;

–ИСО 7346-3:1996. Качество воды. Определение острой летальной токсичности веществ в отношении пресноводных рыб. Часть 3: Метод непрерывного обновления испытательного раствора;

–ISO 10712: Water quality – Pseudomonas putida growth inhibition test (Pseudomonas cell multiplication inhibition test)

–ISO 14240-1 Determination of soil microbial biomass: Part 1: Substrate-induced respiration method;

–ISO 11269-2 Determination of the effects of pollutants on soil flora. Part 2: Effects of chemicals on the emergence and growth of higher plants;

–ISO 11267:2014 Soil quality – Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil contaminants.

Термины, используемые в биотестировании. В экологи-

ческом мониторинге, при разработке и использовании мето-

15

дов биотестирования применяется специфичный понятийный аппарат, без знания которого невозможно правильно организовать процедуры с использованием тест-объектов. Дадим определение основным терминам.

Альготестирование – биотестирование с использованием водорослей.

Биотест – совокупность приемов получения информации о токсичности объектов окружающей среды (вода, почва и др.) или для организмов на основе регистрации реакций тест-объекта.

Биотестирование (биологическое тестирование) –

оценка качества объектов окружающей среды (чаще всего воды, почвы, кормов, различного рода продукции) по ответным реакциям живых организмов, являющихся тестобъектами.

Острое токсическое действие (острая токсичность) –

воздействие, вызывающее быструю ответную реакцию тестобъекта. Чаще всего определяют по тест-реакции «гибель» или «выживаемость» в условиях кратковременного биотестирования. При использовании коловраток и других организмов микрозоопланктона длительность воздействия составляет от 6 до 24 часов.

Гормезис – улучшение прорастания семян, роста, выживаемости или других ответных реакций тест-растений в исследуемых почвах или в почвенных смесях с малыми концентрациями химических веществ, обладающих токсичностью при использовании в больших концентрациях, по сравнению с контролем.

Критерий токсичности – значение показателя токсичности, на основании которого судят о наличии или об отсутствии токсического действия.

16

Подострое токсическое действие – воздействие, вы-

зывающее среднюю по времени ответную реакцию тестобъекта. Чаще всего определяют по тест-реакции «гибель» или «выживаемость» в условиях кратковременного биотестирования. При использовании коловраток и других организмов микрозоопланктона длительность воздействия составляет 48-72 часа.

Популяция – совокупность особей одного вида с общим генофондом, в течение большого числа поколений населяющих определенное пространство с относительно однородными условиями обитания.

Прототестирование – биотестирование с использованием простейших.

Результат биотестирования – конечный вывод о ток-

сичности (или ее отсутствии) пробы.

Референтная почва – незагрязненная почва, отобранная поблизости от загрязненного участка, со свойствами (содержание питательных веществ, рН, содержание органического углерода и механический состав), близкими к свойствам исследуемой почвы.

Тест-культура – лабораторная популяция особей, как правило, одного вида живых организмов (тест-организмов), искусственно поддерживаемая (культивируемая) на питательной среде в стандартных условиях и используемая при оценке токсичности при биотестировании.

Тест-объект – образцы природных или техногенных сред и объектов, которые исследуются методом биотестирования.

Тест-реакция – ответная реакция тест-организмов (или их элементов) на воздействие исследуемого объекта (тест-

17

объекта), выбранная для анализа в определенной тестсистеме.

Тест-система – пространственно-ограниченная среда, которая включает чувствительные организмы (тесторганизмы) или их элементы и образцы исследуемых объектов (тест-объекты).

Тест-функция – для культур одноклеточных водорослей

– гибель клеток, изменение (прирост или убыль) численности клеток в культуре, средняя скорость роста культуры, функциональные (фотосинтетические) характеристики клеток, содержание пигментов.

Токсикологический эксперимент – эксперимент, в ходе которого оценивают влияние на тест-объект испытываемого объекта (вода, почва и др.) или химического соединения. Состоит из двух серий – опыт (проба с возможными токсическими свойствами) и контроль (без токсических свойств).

Токсикометрия – совокупность приемов оценки токсичности вещества или объекта (пробы).

Токсикорезистентность – сопротивляемость организмов к воздействию токсичных веществ.

Фитотестирование – биотестирование с использованием высших растений.

Хемотаксис – двигательные реакции свободно передвигающихся организмов, а также клеток (зооспор, сперматозоидов, лейкоцитов и др.) под влиянием химических раздражителей.

Хроническое токсическое действие (хроническая ток-

сичность) – воздействие, вызывающее ответную реакцию тест-объекта, проявляющуюся в течение относительно длительного периода времени. Измеряют по тест-показателям «выживаемость», «плодовитость», «изменение роста» и другим реакциям при длительном биотестировании.

18

Чувствительность тест-организма – нижняя граница диапазона действия эталонного токсиканта, при которой обнаруживают его токсическое действие.

Эталонный токсикант – токсическое вещество, используемое для проверки чувствительности биотеста или тест-объекта. В качестве эталонного токсиканта чаще всего выступают растворы бихромата калия определенного диапазона концентраций.

1.1 МЕТОДЫ УЧЕТА В БИОТЕСТИРОВАНИИ

Биотест с помощью микроскопических объектов и снятие показаний биотестирования невозможно без использования специального оборудования.

Выбор метода учета тест-параметра определяется методикой исследований, особенностями самого тест-организма и возможностями лаборатории. Наиболее распространен метод прямого определения численности организмов. Для учета крупных объектов (рыбы, ракообразные, инфузории, стилонихии и др.) используются увеличительные стекла, лупы, стереомикроскопы, моно- и бинокулярные микроскопы. Для микроскопических объектов (микроводоросли, инфузории и др.) проводится микроскопирование, в том числе с использованием счетных камер (чаще всего используются счетные камеры Горяева, Тома, Цейса, Фукса-Розенталя), или специальные приборы, такие как гемоцитометр или электронные счетчики клеток. Существуют методы относительного учета. Так, имеются разработки методик, где тест-сигналом является двигательная активность. Для учета двигательной активности может быть использован метод относительного учета визуальным методом или с использованием детекторов движения и специальных компьютерных программ. Для таких исследований можно использовать ракообразных, инфузорий, рыб (Способ биотестирования..., 2008). К методам относительного учета относится также определение уровня флуо-

19