57. Получение белков в чистом виде.

Получение белков в чистом виде.

Есть несколько уровней задач. Если в исследовании важна именно структура, то используют именно чистый белок. Если преследуются цели для технического использования и изучения кинетических свойств, то примеси очищаются не полностью.

Два класса примесей:

·Небелковые примеси. Характерна относительная простота удаления за счет различия в структурном строении и свойства

·Белковые примеси

После получения первичного гомогената, удаляем примеси, желательно как можно быстрее.

Удаление низкомолекулярных примесей осуществляется путем диализа (очистка коллоидных растворов и субстанций высокомолекулярных веществ от растворённых в них низкомолекулярных соединений при помощи полупроницаемой мембраны).

Процесс достаточно медленный, требуется много растворителя, чем больше, тем лучше. Иногда делают ступенчатым.

Капиллярный диализ. То же самое, только еще мельче, а следовательно, и увеличивается чувствительность метода. Внешнее пространство – раствор, внутреннее– гомогенат.

Минусы:

·Полностью очистить нельзя, но уровень все равно низок

·Процесс медленный

Плюсы:

·Объемы большие

Иногда примеси не удаляют, а попросту осаждают белок. Однако, при удалении воды возможно слипание белков и димеризация, тем самым образуется белковый осадок.

58. Высаливание. Методы дезинтеграции клеток.

Высаливание. Принцип:

В белковый раствор добавляют высокие концентрации ионов, которые вызывают слипание белков при связывании воды. Соль должна быть растворимой и не должна влиять на белок. Никаких солей тяжелых металлов, никаких восстановителей/окислителей, никаких фосфатов и так далее.

Хорошей солью может стать сульфат аммония. Экстракт разделяют на порции и разливают в пробирки, затем в каждую добавляют сульфат аммония в соотношениях в процентах от насыщенного. Далее берут либо раствор, либо осадок. Сначала активности нулевые, потом активность постепенно поднимается. В итоге мы получим диаграмму осаждения при разных концентрациях. Далее растворы отсортировывают по концентрациям.

Иногда белок осаждается раньше.

Плюсы:

·Осаждаются только белки и ничего больше,

·Большая стабильность с солью.

Органические растворители.

При взаимодействии с водой хорошо гидратируются. Используют либо этанол, либо ацетон. Смешиваются в любых соотношениях и обладают хорошей гидрофобностью.

Необходима хорошая чистка веществ. Растворители удобнее, так как их можно перегнать. При смешении возможна денатурация, поэтому нужно охлаждение:

·Теплоотвод ·Медленное смешивание ·Ледяная баня

Однако тщательное перемешивание, может быть опасно вспениванием (денатурация белка), так что это делают в толще раствора.

Осадки нельзя высушивать на воздухе, так как происходит разрушение структуры. Поэтому сушат всегда под вакуумом или повторно растворяют.

Методы дезинтеграции клеток

Выделение и очистка ферментов пожалуй самый сложный процесс в энзимологии, требующий знаний особенности выделяемого фермента и его источника, культуры проведения тонких анализов. Каждый отдельный фермент требует к себе особого внимания и подхода. Большинство ферментов выделяют при низких температурах во избежание инактивации. Существуют много способов выделения ферментов как в лабораторных условиях, так и в промышленности.

основные способы:

1.дезинтеграция,

2.экстракция,

3.осаждение (высаливание),

4.хроматография,

5.электрофорез.

Дезинтеграция клеток. в зависимости от локализации по отношению к клеточной мембране фермента бывают внеклеточные (экзоферменты), внутриклеточные (эндоферменты) и мембранные или клеточносвязанные. Если мы получили (вырастили) суспензию клеток или культуральную жидкость, ферменты будут по разному распределятся в этой жидкости. Некоторые ферменты выделены клетками наружу и находятся в к/ж, некоторые сидят в стенках клеток, некоторые заключены в клетки. Ясно, что для выделения первых можно клетки не трогать, просто отделить, а вот для выделения 2-х и 3-х необходимо разрушить клетки.

Процесс разрушения клеточной стенки называют дезинтеграцией. Существуют несколько методов дезинтеграции (разрушения).

· -механические: баллистический, экструзионный, декомпрессионный;

· -физические: осмос и термошоки, плазмолиз, криотехника, ультразвук, сушка, ионизирующая радиация, температура

· -химические: действие кислот, щелочей, солей, органических растворителей, ПАВ, сдвиг рН;

· -энзиматические: действие литических ферментов (лизоцим; · -биологические: действие фагов, антибиотиков.

Чаще всего первой стадией получение ферментов является получение гомогената. Гомогенат получают измельчением биологического материала (растительная или животная ткань, мицелий и т.д.) в ступке с добавлением песка или осколков стекла, или в специальных гомогенизаторах. В настоящие время применяют различные модели гомогенизаторов. Основной принцип работы этих аппаратов заключается в следующим: в стеклянной или металлическом стакане поступательно-вращательно перемешивается хорошо подогнанный к стенкам стакана металлический, стеклянный или фторопластовый шток. Предварительно измельченная биологическая ткань попадая между стенкой и штоком с наконечником механическим разрушаются. Подбирая обороты, тип гомогенизатора, среду можно выделить очень большой класс ферментов.

В последние время очень широко применяют УЗ-дезинтеграторы. Здесь также необходимо подобрать такие условия, чтобы исключить максимально инактивацию ферментов. Хорошим способом разрушения большинства микробных клеток является перематывание шариками, состоящие во встряхивании клеток с маленькими стеклянными шариками в быстро вибрирующем сосуде.

Дезинтегрирующие действие химических соединений заключается в нарушение меж. И внутримолекулярных связей между структурными элементами клеточной стенки за счет связывание ионов металлов, удаление липидов и т.д.

При энзиматической дезинтеграции можно выделять малоустойчивые внутриклеточные структуры. Ферменты или ферментные комплексы литического действия получают из бактерий, грибов, тканей животных и растений. Например, в состав дрожжелитического ферментного комплекса входят различные глюконазы, протеазы, хитиназы. Из-за различия в строение клеточных стенок в зависимости от рода, вида, штамма одних и тех же клеток, в каждом конкретном случае необходимо подбирать соответствующий ферментный комплекс. Особенно большой скачок в использовании энзиматической дезинтеграции был сделан после применение иммобилизованных ферментов.

Биологическая дезинтеграция осуществляется фагами, бактериоцинами вызывающих лизис клетки ведущий и распаду клетки. Если ферменты прочно связаны с внутриклеточными структурами, то вначале выделяют эти структуры дифференциальном центрифугированием, а затем экстрагируют из них ферменты органическими растворителями или водными растворами дозоксихолата, твина и т.д. (детергенты).