2. Получение микробных и вирусных вакцин
Получение и стандартизация вакцин происходит в следующей очередности:
Получение и характеристика исходного штамма.
Получение биомассы (выбор способа культивирования микроорганизмов, вируса).
Выделение антигенной структуры (осаждение, высаливание, сорбция, элюирование, ультрафильтрация и др.).
Его инактивация (формалин, фенол, перекись водорода, нагревание и др.), очистка, стерилизация (термическая, облучение, фильтрация).
Розлив.
Стандартизация.
Упаковка.
Живые вакцины – взвесь аттенуированных микроорганизмов, выращенных на различных питательных субстратах.
Изготавливают из ослабленных и авирулентных штаммов. Вакцинный штамм размножается в организме привитого и вызывает вакциниальный инфекционный процесс. Например, вакцина для профилактики краснухи, кори, полиомиелита, туберкулеза и паротита.
Живые бактерийные вакцины выращиваются на жидкой питательной среде в ферментере. Живые вирусные вакцины получают путем культивирования штамма в курином эмбрионе (вакцина против гриппа, бешенства, клещевого энцефалита) или в культурах животных клеток: первичные культуры клеток (живая полиомиелитная вакцина) и перевиваемые культуры клеток (VERO-инактивированная полиомиелитная вакцина). Живые вакцины представляют собой лиофилизаты, хранящиеся при 2–8ºС без консервантов в герметичных стеклянных ампулах. Необходимо строгое соблюдение условий асептики.
Убитые (инактивированные) вакцины можно получить из целых микробных клеток, которые инактивируют температурой, ультрафиолетовым облучением, формалином, спиртом. Необходим строгий контроль инактивациии. Обладают более низкой эффективностью в сравнении с живыми вакцинами. Необходима очистка вакцины от клеточных элементов, чужеродной ДНК и нежелательных АГ.
Недостатки корпускулярных (живых и инактивированных) вакцин. Не все патогенные микроорганизмы можно вырастить в количествах, необходимых для производства. Строгое соблюдение мер предосторожности по избеганию инфицирования персонала. Инактивация может быть неполной. Аттенуированные штаммы могут ревертировать и становиться вирулентными.
Рекомбинантные вакцины. Для получения рекомбинантной вакцины клонируют гены, обеспечивающие синтез необходимых антигенов. Затем вводят гены в вектор (плазмида, вирус) и далее вводят вектор в клетки-продуценты (вирусы, бактерии, грибы, клетки животных). Далее осуществляют культивирование клеток in vitro, отделяют и очищают антиген.
Рассмотрим процесс получения микробных вакцин на примере дифтерийной вакцины. Дифтерийный токсин состоит из двух субъединиц: А (24 кДа, 193 аминокислоты, 6 пептидов) и В (38кДа, 414 аминокислот, 4 пептида) и вырабатывается промышленным штаммом Corynebacterium diphtheriae PW-8 (Парк-Вильямс 8). После нагревания в течение 30 мин при 60ºС теряет свою токсичность.
Для получения дифтерийного токсина используют среду Lingood. Состав: триптически гидролизованная говяжья ткань и свиная поджелудочная железа (параметры гидролиза: рН 8,0–8,2; температура 48– 50ºС; гидролиз останавливают добавлением ледяной уксусной кислоты и кипячением смеси), содержание аминного азота в гидролизате составляет 120–130 мг/л. К полученному гидролизату добавляют пекарские дрожжи для сбраживания сахаров при 80ºС в течение одного часа. Затем добавляют натрия лактат и мальтозу. Стерилизуют среду при 112ºС в течение 30 мин.
Аэрирование (воздух подают со скоростью 6–10 л/мин) и перемешивают (1200–1400 обор/мин), для ускорения образования токсина. Ферментацию проводят при 34–36ºС в течение 36–50 ч.
После процесса культивирования сепарацию проводят путем центрифугирования на суперцентрифугах при 15000 обор/мин. Токсин накапливается в культуральной жидкости.
К профильтрованной путем ультрафильтрации культуральной жидкости при медленном перемешивании (60–80 обор/мин) прибавляют 40% формальдегид и инкубируют при 39–40ºС 5 суток. За это время происходит детоксикация токсина, связанная с образованием метиламинных групп (обратимая стадия), которые, взаимодействуя с индольными, амидными, фенольными радикалами аминокислот, формируют стабильные метиленовые мостики (необратимая стадия). Затем охлаждают до 2–8ºС.
Очистку проводят путем добавления натрия гексаметафосфата (соль Грехема) при постоянном перемешивании. Добавляют трихлоруксусную кислоту до изоэлектрического значения рН 3,8–4,0. Инкубируют 40–60 мин при температуре 4–10ºС. Осадок отделяют на суперцентрифугах при 12000 обор/мин. Растворят в боратно-буферном растворе при рН 7,8–7,9. Очистку от пигментов проводят на активированном угле.