Приготовление и исследование густых экстрактов шиповника
Сырье
Для приготовления экстрактов были использованы сухие листья черной смородины, собранные в мае 2012 г. Сушили сырьё при комнатной температуре без доступа солнечного света.
Методика приготовления гексанового и ацетонового экстракта листьев черной смородины
Масса листьев для одного экстракта = 30,00 г.
Навеска измельченных листьев черной смородины (1 мм) помещалась в стеклянную емкость, после чего заливалась растворителем так, чтобы уровень растворителя был выше уровня сырья примерно на 1 см. Далее емкость плотно закрывали крышкой и помещали в темное место. Через три дня вытяжку сливали, а листья заливали новой порцией растворителя. Таким образом, было получено по 5 вытяжек каждого растворителя.
Процесс выделения основан на сходстве выделяемого компонента с растворителем: при пропускании последнего через смесь он «захватывает» с собой нужное вещество и выводит его из системы. Таким образом, на выходе получается смесь экстрагируемого вещества с растворителем, следовательно, в этой смеси не должно происходить никаких химических реакций (компоненты должны быть инертны друг к другу, наличие примесей в растворителе также может привести к нежелательным изменениям). Дальнейшее разделение основано на испарении растворителя, желательно использовать низкокипящие растворители, чтобы избежать термического разложения экстрагируемого вещества. Экстрагируемый компонент концентрируется в емкости для растворителя.
Достоинство этого метода экстракции в том, что с навеской постоянно контактирует чистый растворитель, который не подвергается нагреванию. Нагревание в данном случае может привести к разложению экстрагируемых веществ. Однако этот метод требует больших временных затрат.
Окончание процесса обезжиривания определяли по празрачности растворителя, который сливали после отстаивания.
Масса листьев после экстракции: листья экстрагируемые ацетоном: m = 25,27г; листья экстрагируемые гексаном: m = 27,75 г.
УФ-спектрофотометрия экстрактов черной смородины
Для количественного определения БАВ в растительном сырье наибольшее распространение получили физико-химические методы, прежде всего фотоколориметрия и спектрофотометрия. Они имеют ряд существенных преимуществ по сравнению, например, с гравиметрическими и титрометрическими методами, а именно быстрота и точность определения, обнаружение даже незначительных количеств и, что особенно важно, возможность выделения отдельных БАВ из растительного сырья.
Исследование качественного состава экстрактов черной смородины проводили спектрофотометрическим методом.
Спектрофотометрический метод основан на способности БАВ поглощать свет в определенной области спектра.
Спектры оптического поглощения экстрактивных вытяжек регистрировали на спектрофотометре VARIAN Cory 50 cons при комнатной температуре в диапазоне длин волн 220-800 нм. Раствором сравнения служили ацетон, этиловый спирт и гексан.
Приготовления гексанового раствора гексанового экстракта листьев черной смородины:
Навеску гексанового экстракта помещали в пенициллинку и заливали 3 мл гексана. Тщательно перемешивали до полного растворения. Из полученного раствора дозатором отобрали 100 мкл и разбавили 5 мл гексана. Концентрацию окрашенных экстрактов проводим по формуле:
Приготовления ацетонового раствора гексанового экстракта листьев черной смородины:
Навеску гексанового экстракта 0,0095 г разбавили 3 мл ацетона. Тщательно перемешали до полного растворения. Из полученного раствора дозатором отобрали 100 мкл и разбавили 5 мл ацетона.
Приготовления спиртового раствора гексанового экстракта листьев черной смородины:
Навеску гексанового экстракта 0,01 г разбавили 3 мл спирта. Тщательно перемешали до полного растворения. Из полученного раствора дозатором отобрали 100 мкл и разбавили 5 мл спирта.
Рис. 1 Спекты гексанового экстракта листьев черной смородины в различных растворителях.
Приготовления гексанового раствора ацетонового экстракта листьев черной смородины:
Навеску ацетонового экстракта помещали в пенициллинку и заливали 3 мл гексана. Тщательно перемешивали до полного растворения. Из полученного раствора дозатором отобрали 100 мкл и разбавили 5 мл гексана. Концентрацию окрашенных экстрактов проводим по формуле:
Приготовления ацетонового раствора ацетонового экстракта листьев черной смородины:
Навеску ацетонового экстракта 0,0095 г разбавили 3 мл ацетона. Тщательно перемешали до полного растворения. Из полученного раствора дозатором отобрали 100 мкл и разбавили 5 мл ацетона.
Приготовления спиртового раствора ацетонового экстракта листьев черной смородины:
Навеску ацетонового экстракта 0,01 г разбавили 3 мл спирта. Тщательно перемешали до полного растворения. Из полученного раствора дозатором отобрали 100 мкл и разбавили 5 мл спирта.
Рис. 2 Спекты ацетонового экстракта листьев черной смородины в различных растворителях.
Выводы: Полоса поглощения в УФ спектре при 450 нм, характерная для β-каротина присутствует в УФ спектрах гексанового экстракта.
Количественный анализ густых экстрактов
Методика определения содержания хлорофилла а, хлорофилла b и каротиноидов
Количественное определение пигментов основано на их способности к поглощению лучей определенной длины волны. Регистрацию оптической плотности раствора пигментов проводят на спектрофотометре. При использовании спектрофотометрии для определения концентрации хлорофилла a и b в растворе без их разделения вопрос осложняется тем, что спектры хлорофиллов a и b сильно перекрываются и невозможно найти две длины волны, в которых поглощение обуславливалось бы полностью одним пигментом. Однако имеющиеся различия в спектрах поглощения обоих хлорофиллов все же позволяют выбрать точки, где поглощение одного пигмента заметно превышает поглощение другого. Это обстоятельство и используется при проведении количественного определения хлорофилла a и b без их разделения. Концентрацию хлорофилла a и b в вытяжке рассчитывают по формуле Вернона:
В 100 %-ном ацетоне:
Ca(мг/л) = 9,784∙D662 – 0,990∙D644, (3.1)
Cb(мг/л) = 21,426∙D644 – 4,650∙D662; (3.2)
Для определения концентрации каротиноидов (мг/л) в суммарной вытяжке пигментов может быть использована формула Веттштейна:
Скар = 4,695∙D440,5 – 0,268(Ca+b), [45] (3.3)
Поскольку у нас имеются экспериментальные данные значений оптической плотности густого экстракта в 100%-ном ацетоне при длине волны 662 и 664 нм, то мы можем воспользоваться данным методом:
Ацетоновый экстракт:
Ca = 9,784∙ 0,07854– 0,990∙ 0,02197= 0,7467 (мг/л),
Cb= 21,426∙0,02197– 4,650∙0,07854= 0,1055 (мг/л),
Скар = 4,695∙0,11036– 0,268(0,7467 +0,1055) = 0,2897 (мг/л);
Гексановый экстракт:
Ca = 9,784∙0,02876– 0,990∙0,006884 = 0,2746 (мг/л),
Cb= 21,426∙0,006884 – 4,650∙0,02876= 0,01376 (мг/л),
Скар = 4,695∙0,05139– 0,268(0,2746 +0,01376) = 0,16399 (мг/л);
Установив концентрацию пигментов в вытяжке, определяли их содержание в исследуемом материале с учетом объема вытяжки и навески пробы:
A = V∙C/(P∙1000), (3.4)
где С – концентрация пигментов в мг/л; V – объем вытяжки в мл; P – навеска экстракта в г; А – содержание пигмента в растительном материале в мг/г экстракта.
Ацетоновый экстракт:
Aa = 8∙0,7467 /(0,00323∙1000) = 1,849 мг/г,
Ab = 8∙0,1055 /(0,00323∙1000) = 0,261 мг/г,
Акар =8∙0,2897 /(0,00323∙1000) = 0,718 мг/г.
Гексановый экстракт:
Aa = 8∙0,2746 /(0,0035∙1000) = 0,628 мг/г,
Ab = 8∙0,01376 /(0,0035∙1000) = 0,0315 мг/г,
Акар =8∙0,16399 /(0,0035∙1000) = 0,375 мг/г.
Таким образом, мы установили, что в 1 г ацетонового экстракта содержится 1,849 мг хлорофилла а, 0,261 мг хлорофилла b и 0,718 мг каротиноидов, а в 1 г гексанового экстракта - 0,628 мг хлорофилла а, 0,0315 мг хлорофилла b и 0,375 мг каротиноидов. Таким образом, можно сделать вывод, что ацетон обладает большим экстрагирующим действием, нежели гексан.
2) Методика определения суммарного содержания каротиноидов в пересчете на β-каротин.
Оптическую плотность раствора измеряют на спектрофотометре при длине волны 450 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют гексан. Содержание суммы каротиноидов (Х) в мг% в пересчете на β-каротин и абсолютно сухом сырье рассчитывают по формуле:
где D – оптическая плотность исследуемого раствора; V – объем раствора, мл (100 мл); m – масса сырья, г; W – потеря в массе при высушивании сырья, %; 2592 – удельный показатель поглощения 1% 1см E β-каротина при длине волны 450 нм в гексане.
Гексановый экстракт
мг%
Ацетоновый экстракт
мг%
Определение массовой доли каротина.
Раствор перемешать и колориметрировать на спектрофотометре при длине волны 450 им в кювете с рабочей длиной 10 мм. Параллельно измерить оптическую плотность раствора стандартного образца — дихромата калия. В качестве раствора сравнения использовать экстрагент (соответственно гексан).
Содержание каротиноидов в пересчете на β-каротин (Xкар, мкг%) вычислить по формуле
где D - оптическая плотность исследуемого раствора;
D0 - оптическая плотность раствора стандартного образца;
0,0208 — количество β-каротина, соответствующие по окраске 1 мл стандартного
раствора калия дихромата, мкг;
V— объем экстракта, мл;0,053643968
m - масса навески, г;
100—коэффициент пересчета в проценты
Гексановый экстракт
1,567
мг%
Ацетоновый экстракт
мг%