книги / Основы взаимодействия физических полей с биологическими объектами. Воздействие ионизирующего и оптического излучения

стояния в основное (см. В2). Такой переход, как правило, является термодинамически неравновесным. Люминесценция делится на хемилюминесценцию, флуоресценцию, фосфоресценцию и др.

Напомним, что хемилюминесценция обусловлена преобразо­ ванием энергии химических процессов в излучение. В данном слу­ чае нас интересует биолюминесценция, т. е. разновидность хеми­ люминесценции, представляющая собой те виды люминесценции живых тканей, которые не связаны с воздействием на них какойлибо внешней энергии излучения.

Биолюминесценция обусловлена определенными химическими процессами, протекающими в живых клетках, и, к примеру, сопровождает образование свободных радикалов. Биолюминесцентные тесты используются в качестве индикаторов определен­ ных биохимических реакций. Биолюминесцентное излучение мо­ жет захватывать как ультрафиолетовую, так и видимую область спектра.

В природе преобладает биолюминесценция желто-зеленой об­ ласти, отчетливо выраженная у микроорганизмов, беспозвоноч­ ных, глубоководных рыб. Теплокровные обладают весьма слабой по сравнению с другими представителями флоры и фауны биолю­ минесценцией. Этот факт является источником диагностической информации (увеличение фона биолюминесценции тканей означа­ ет наличие патологии). Для количественного анализа биолюми­ несценции необходимы чувствительные приборы, способные из­ мерять интенсивность излучения на уровне отдельных квантов. Видимый свет подавляет биолюминесценцию клеток, что было изучено еще С.И. Вавиловым, высказавшим ряд весьма плодо­ творных идей касательно изучения люминесценции.

Флуоресценция и фосфоресценция представляют собой переизлучение предварительно поглощенного света (см. В2). Они обу­ словлены переходами внешних валентных электронов. Именно эти электроны ответственны за химические связи, поэтому люминес­ центный анализ исключительно информативен при изучении ди­ намики молекулярных структур.

Временной диапазон между поглощением излучения и его по­ следующим испусканием достаточен для протекания целого ряда процессов, каждый из которых ведет к изменению наблюдаемой характеристики флуоресценции. К таким процессам относятся: столкновения с молекулами тушителя флуоресценции (например,

О2), вращательная и поступательная диффузия, образование ком­ плексов с растворителем или растворенными веществами и т. д.

101

Основные параметры флуоресценции [9].

1. Интенсивность флуоресценции - число излучаемых фотонов dN^n в полосе dXфл на длине волны А,фл при данной интенсив­

ности возбуждения:

^фл — ^ ^ ф л •

2. Спектр возбуждения - зависимость интенсивности флуорес­ ценции /фл на длине волны Хфл от длины волны возбуждающего

излучения А.в :

Спектр возбуждения подобен спектру поглощения и его изучение позволяет ответить на вопрос, какая длина волны возбуждения Хв

вызывает наиболее интенсивную флуоресценцию, а также, если в растворе находится набор флуоресцирующих молекул, какому именно флуорофору отвечает данная А.фл.

3. Спектр флуоресценции - зависимость интенсивности флуо­ ресценции /фл при данной длине волны возбуждения Хв от длины

волны флуоресценции Хфп:

/фл (^в) “ dN*n f ^^фл> “ const,

т. е. распределение интенсивности излучаемого света по частотам (длинам волн).

Согласно правилу Стокса, максимум в спектре люминесценции всегда сдвинут в сторону длинных волн по отношению к спектру поглощения, порождающему люминесценцию. Это легко объяс­ нить, придерживаясь приближения Борна - Оппенгеймера (см. В2). Запишем полную энергию молекулы:

£ ~ ^эл + ^кол + ^вр •

Она представляет собой сумму энергии движения электронов в разрешенных состояниях, энергии колебаний атомов в молекуле и энергии вращения молекулы как целого. Спектры люминесценции определяются только электронной составляющей полной энергии, тогда как поглощенная энергия распределяется между всеми тремя составляющими.

В принципе, знание спектров поглощения и люминесценции позволяет полностью описать процесс, но на практике эта задача

102

очень трудно разрешима. Как уже указывалось, люминесценция биообъектов обладает очень слабой интенсивностью. Для измере­ ния эмиссионного спектра требуется аппаратура с чувствительно­ стью на уровне счета отдельных квантов. Казалось бы, несколько лучше обстоит дело со спектром поглощения - для просвечивания образца можно использовать достаточно мощный источник света, и на пределе чувствительности работать необязательно. Однако, как только интенсивность падающего света возрастает, начинает проявляться нелинейность биосреды, поскольку коэффициент по­ глощения существенно зависит от интенсивности. В результате измеряется вовсе не тот спектр, который требуется. Эксперимен­ таторы давно сумели преодолеть эту трудность с помощью опре­ деления спектра возбуждения. При этом нелинейность спектра поглощения исключается из рассмотрения вследствие того, что измеряется интегральная интенсивность, которая достаточно ве­ лика и, что особенно важно, не требует установления характера спектральной зависимости испускания. В то же время длину вол­ ны зондирующего излучения можно задавать с высокой точно­ стью, и тогда спектр возбуждения получается идентичным спектру поглощения, но без нелинейных особенностей.

4. Квантовый выход флуоресценции т)фл- отношение числа

излучаемых за секунду квантов 7Уфл к числу поглощенных за се­

кунду квантовNu:

Лфл - Л ^ п .

Согласно закону Вавилова, квантовый выход люминесценции по­ стоянен и не зависит от того, светом какой длины волны облучает­ ся молекула. Квантовый выход флуоресценции меняется при на­ личии тушителей флуоресценции, олигомеризации и т. д.

5. Время жизни (затухания) х флуоресценции - время, в течение которого интенсивность флуоресценции уменьшается до уровня Me начального значения; связь между интенсивностью флуоресценции /фл и временем жизни т определяется выражением

^фл = АфпО^ у

где /фл0 - максимальная интенсивность флуоресценции во время

возбуждения. Время жизни флуоресценции зависит от типа рас­ творителя (окружающих молекул), от связи с другими молекула­ ми, олигомеризации, изменения конформации молекул и т. д.

103

Основываясь на принципах расчета молекулярных спектров по Борну - Оппенгеймеру, можно вычислить собственное излуча­ тельное время жизни возбужденного состояния, которое для флуоресценции составляет

v max J n ( v ) ^ v *

где vmax - средняя частота полосы поглощения; p(v) - частотная

зависимость коэффициента экстинкции. Величина 'т 0 представ­

ляет собой время жизни возбужденного состояния в отсутствие других путей потери энергии возбуждения (см. рис. 3.5). Если по­ лоса поглощения симметрична, то (3.4) можно упростить:

глощения; AVJ/2 ~ ширина полосы на половине высоты. Таким образом, можно рассчитать излучательное время жизни возбуж­ денного состояния из спектроскопических данных. Флуоресцен­ ция является относительно быстрым процессом, поскольку излу­ чательный переход разрешен: обычно Чо = 10_6... КГ9 с. Это

время велико по сравнению с единичным актом первичного по­ глощения (10-15с), но в то же время оно мало по сравнению со временем распада возбужденного состояния при биолюминесцен­ ции и фосфоресценции. Отметим также, что вычисляемое таким образом время флуоресценции больше, чем экспериментально оп­ ределяемое, поскольку фактическое время 1т0 представляет собой величину, обратную сумме всех констант скоростей процессов распада возбужденного состояния.

Излучательное время жизни фосфоресценции

где g3 и g\ - факторы вырождения триплетного и синглетного со­ стояний соответственно. Такие запрещенные переходы (см. В2)

104

имеют малые коэффициенты экстинкции, и поэтому время жизни,

о

вычисленное из (3.6), оказывается большим (от 10 с до несколь­ ких минут и даже часов). Это эквивалентно утверждению, что со­ стояние, которое трудно заселить путем непосредственного воз­ буждения, также трудно распадается в результате излучательного процесса. По этой причине триплетные состояния играют преоб­ ладающую роль в фотохимии биомолекул, поскольку при прочих равных условиях они живут гораздо дольше синглетных и имеют более высокую вероятность вступить в фотохимическую реакцию. Этот факт усугубляется еще и тем обстоятельством, что в три­ плетном состоянии внешние электроны не спарены.

6. Степень поляризации Р и степень анизотропии г флуорес­ ценции - распределение электромагнитных колебаний относи­ тельно направления наблюдения.

Степень поляризации флуоресценции Р - это доля поляризо­ ванного света в общей суммарной интенсивности флуоресценции (см. В2). За время жизни т возбужденного состояния молекула ус­ певает повернуться, происходит деполяризация излучения по сравнению с поглощенным квантом. Деполяризация тем больше, чем быстрее поворачивается молекула, т. е. чем меньше вязкость ее окружения. Поэтому поляризацию флуоресценции определяют, чтобы, например, изучить микровязкость структуры клетки.

Согласно формуле Перрена - Яблонского,

\/P - 1 /3 = (1/PQ -1/3)(1 + RTT /V T]\

где Р0 - максимальная степень поляризации; т - время жизни флуоресценции; V - объем моля флуоресцирующих молекул; г\ - вязкость среды.

Поляризация флуоресценции несет информацию о молекуляр­ ной организации биообъектов и патологических изменениях в тка­ нях, клетках и субклеточных структурах.

Анизотропное световое возбуждение позволяет выделить из хаотической группы атомов или молекул определенную группу.

Многие важные биологические объекты характеризуются соб­ ственной флуоресценцией или имеют флуоресцирующие компо- ненты-флуорофоры. Собственную флуоресценцию не следует пу­ тать с биолюминесценцией. Напомним, что биолюминесценция есть процесс преобразования энергии химических реакций, в ко­ торых участвуют биомолекулы, в энергию электромагнитного из­ лучения. Поглощение при биолюминесценции отсутствует. Собст­

105

венная люминесценция есть процесс высвечивания биотканями предварительно поглощенной энергии электромагнитного излуче­ ния в виде электромагнитного же излучения.

Например, около 90 % флуоресценции белков обусловлено на­ личием в них ароматической аминокислоты триптофана, осталь­ ная часть приходится на тирозин, фенилаланин, цестеин и цистин. Квантовый выход УФ-флуоресценции живой клетки составляет

третичной структуры. Спектры поглощения и испускания трипто­ фана, тирозина и фенилаланина изображены на рис. 3.7.

Рис. 3.7. Спектры поглощения (а) и флуоресценции (б) триптофана (/), тирозина (2) и фенилаланина (3)

Спектр поглощения триптофана определяется его индольным кольцом. Этой аминокислоте присущи две полосы поглощения: первая с максимумом в области 218 нм, вторая (преобладающая) - в области 280 нм. Даже малое содержание триптофана в белке существенно влияет на характер его спектров, так как молярный коэффициент поглощения этой аминокислоты в 4 раза больше, чем тирозина, и почти в 30 раз больше, чем фенилаланина. При возбуждении молекул раствора триптофана ультрафиолетом с к < 300 нм возникает его флуоресценция, максимум которой при­ ходится на к * 350 нм. Квантовый выход флуоресценции трипто­ фана в нейтральном водном растворе при комнатной температуре достигает 0,2.

Спектр поглощения тирозина обусловлен его фенольным коль­ цом. Максимумы в спектре поглощения приходятся на 222 и

106

275 нм. В нейтральном водном растворе при комнатной тем­ пературе максимум флуоресценции тирозина приходится на 303. ..304 нм, квантовый выход равен 0,21.

Спектры поглощения и флуоресценции фенилаланина связаны с наличием бензольного кольца. Максимум в спектре поглощения приходится на 257 нм, квантовый выход невелик - 0,038-0,045.

Если белок содержит все три аминокислоты, то в суммарном спектре флуоресценции преобладает триптофановая люминесцен­ ция. При отсутствии триптофана спектры флуоресценции белко­ вой молекулы и тирозина практически совпадают. Свечение фени­ лаланина проявляется только при отсутствии других аромати­ ческих аминокислот. Таким образом, анализ спектров флуорес­ ценции белка дает возможность прецизионного распознавания его состава. В клетках человека содержится много белков, в состав которых входят перечисленные аминокислоты. Это актин, миозин, тропонин, ферменты типа дегидрогеназы, фосфатазы, оксидазы, некоторые гормоны (АКТГ, СТГ, тиреоглобулин и др), пищевари­ тельные ферменты (пепсин, трипсин, химотрипсин), альбумины и глобулины плазмы крови и ряд других веществ. Собственная ультрафиолетовая флуоресценция этих белков определяется глав­ ным образом триптофаном, причем их спектры излучения сдвину­ ты в сторону коротких волн на 10...25 нм относительно спектров люминесценции водного раствора триптофана. Спектры белков, содержащих тирозин и фенилаланин в отсутствие триптофана и люминесцирующих практически так же, как и тирозин, свойствен­ ны РНКазе*, гистонам, коллагену, тропомиозину, инсулину и ряду других веществ. Их максимум практически совпадает с максиму­ мом флуоресценции водного раствора тирозина (X = 304 нм). Квантовый выход здесь мал (не выше 0,1, чаще 0,04-0,05).

Флуоресцируют также восстановленные пиридин-нуклеотиды

НАД-Н и НАДф” -Н2 (Хфл = 440...480 нм) и окисленные флаво-

протеины (ФП) (Хфл = 510...540 нм), которые участвуют во внут­ риклеточных процессах: гликолиз, цикл Кребса, дыхание. Поэтому при флуоресцентном анализе могут быть выявлены любые сдвиги в клеточном метаболизме, отражающиеся на динамике свойств НАД-Н и ФП.

’ РНК - рибонуклеиновая кислота.

"" НАД - никотинамидадениндинуклеотид, НАДФ - никотинамидаденинди- нуклеотид-фосфат.

107

Собственной флуоресценцией в УФ-диапазоне обладают со­ кратительный аппарат клетки, митохондрии и некоторые другие клеточные структуры, причем ее интенсивность зависит от физио­ логического состояния клеток и меняется при различных воздей­ ствиях на них. Порфирины флуоресцируют в красной области спектра (630...670 нм).

Спектры собственной ультрафиолетовой флуоресценции раз­ личных клеток имеют качественное сходство. Различие в основ­ ном просматривается в интенсивности свечения. Наиболее интен­ сивно светятся клетки мышц, на 25...30 % слабее - нейроны и примерно вдвое слабее - гепатоциты. Измерение относительных величин свечения различных клеток в области 300...350 нм позво­ ляет получать диагностическую информацию о состоянии соот­ ветствующих тканей.

Поскольку флуоресценция в некоторых случаях очень слаба, для получения информации используют сторонние флуорофоры в качестве меток, или зондов. Флуоресцентные зонды, например, позволяют определить поверхностный заряд или трансмембран­ ный потенциал клеточных мембран, изменение конформации бел­ ков и т. д. С их помощью можно проводить диагностику многих заболеваний, например аллергии, токсикоза, атеросклероза, рако­ вых опухолей и т. д.

3.7. ОПТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БИОТКАНЕЙ

Биоткани являются рассеивающими средами. Максимум про­ пускания биотканей находится в области 1,1 мкм. Наиболее «про­ зрачен» живой организм на длинах волн 650... 1200 нм, поскольку здесь пересекаются области наименьшего поглощения излучения водой и гемоглобином крови. Иногда еще более сужают область прозрачности мягких тканей, выделяя «окно» 800... 1100 нм. При X, = 450...620 нм глубина проникновения излучения в биоткань составляет 0,25...2,5 мм, обратное рассеяние составляет сущест­ венную часть отраженного света и соответствует приблизительно 40 %. Глубина проникновения зависит также от поглощения света определенных длин волн теми или иными структурами.

Кровь практически прозрачна для ИК-излучения фотографиче­ ского диапазона, так как окисленный и восстановленный гемогло­ бин в ближней ИК-области (до I мкм) поглощает и рассеивает из­ лучение слабо.

Рассмотрим ИК-излучение поверхности тела человека:

108

Максимум излучения телом человека приходится на длину волны 9,5 мкм.

Основной тканью, участвующей во взаимодействии с ЭМИ оп­ тического диапазона, является кожа.

Кожа состоит из эпидермиса и дермы. В состав эпидермиса входят роговой слой (570 мкм), блестящий слой (40 мкм), зерни­ стый слой (20 мкм), слой щиповидных клеток (90 мкм), базальный слой (20 мкм). Дерма составляет около 1000 мкм. В роговом слое основными поглощающими хромофорами являются тирозильные остатки кератина и других белков. Коротковолновая граница про­ пускания рогового слоя равна 280...290 нм, в нем оптическая плотность слоя больше 20. Вся кожа практически не пропускает свет с X < 300 нм, а свет с X = 290...300 нм доходит, видимо, толь­ ко до щиповидных клеток.

На рис. 3.8 [34] изображено спектральное пропускание излу­ чения кожей человека. Видно, что крайнее красное и ближнее ИК-излучения пропускаются эпидермисом и всей толщей кожи значительно лучше, чем видимое излучение. Излучение с X > > 1,5...2,0 мкм полностью поглощается содержащейся в тканях во­ дой, значит, кожа для этого излучения непрозрачна.

Рис. 3.8. Спектральное пропускание излучения кожей человека:

1 - эпидермисом; 2 - всей толщей кожи

На рис. 3.9 [31] представлены спектры отражения кожи чело­ века. В клетках кожи предусмотрена меланиновая система фото­ защиты, с помощью которой внутри клеток при освещении проис­ ходит перераспределение сильно поглощающих меланопротеиновых гранул и увеличение количества меланина. В результате

109