Тема 6. Молекулярно-генетический метод лабораторной диагностики инфекционных заболеваний

План лекции

1. Метод молекулярной гибридизации.

2. Этапы постановки ПЦР. Применение ПЦР в диагностике бактериальных и вирусных инфекций.

3. Современные методы Саузерн- и Нозерн- блоттинг.

1. Метод молекулярной гибридизации

Позволяет выявить степень сходства различных ДНК. Применяется для идентификации микробов для их точного таксономического положения. Основан на способности двухцепочечной ДНК при t 90⁰C в щелочной среде денатурировать, т.е. расплетаться на две нити, а при понижении t на 10⁰C вновь восстанавливать исходную двунитевую структуру. Метод требует наличия зонда, т.е. одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты, меченной радионуклидами, с которой сравнивают исслед.ДНК.

Молекулярную гибридизацию проводят так. Расплетают молекулу исслед. ДНК, одну нить закрепляют на специальном фильтре, который помещают в раствор с радиоактивным зондом. Образуются двойные спирали. При наличии комплементарности между зондом и исследуемой ДНК они образуют двойную спираль.

2. Этапы постановки пцр. Применение пцр в диагностике бактериальных и вирусных инфекций

Полимеразная цепная реакция ПЦР позволяет обнаружить микроб в исследуемом материале по наличию в нем ДНК без выделения микроба в чистую культуру. Применяется для диагностики вирусных и бактериальных инфекций.

ПЦР основана на амплификации, т.е. увеличении количества копий специфического (маркерного) гена возбудителя. Для этого двунитевую ДНК, выделенную из материала, денатирируют («расплетают» при нагревании 94ºС 1 мин — стадия «плавления») и достраивают (при охлаждении 45-65ºС в течение 1-1,5 мин) к расплетенным нитям ДНК новые комплементарные нити. Используют праймеры, комплементарные определенному участку ДНК возбудителя. Праймеры получают из известных генов различных возбудителей в аппаратах -синтезаторах, сост. из 20-30 аминокислотных остатков. Нужно знать нуклеот. последовательность объекта исследования (вирус, бактерия и т.д.). Имеются данные о геноме различных патогенных микробов и ими пользуются при постановке ПЦР. Для ПЦР необходимо два праймера, каждый из которых комплементарен одной из цепей двуцепочечной молекулы ДНК. Присоединение («отжиг») праймеров происходит так: к образовавшимся в результате денатурации одноцепочечным ДНК присоединяются праймеры — один к 3' — концу выбранного для удвоения участка, второй — к 5' — концу. Этот этап называют «отжигом». Поддерживается температура 72°С оптим. t для полимеразы, применяемой в ПЦР. Фермент достраивает комплементарные цепи ДНК, начиная с 3'- концов праймеров навстречу друг другу. Этот этап называется «элонгация» (удлинение). С каждым циклом количество ДНК удваивается.

Цикл повторяется при указанных t режимах (94º, 45-65º и 72º) автоматически с помощью амплификаторов (термоциклеров). Проводится 30 циклов, что позволяет получить 2³⁰ копий участка ДНК возбудителя.

3. Современные методы Саузерн- и Нозерн- блоттинг — высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.

Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их (блоттинг) из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Есть такие бумажные полоски с «блотами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Инкубируют, затем отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс (антиген+антитело больного+антитело против Ig человека) выявляют с помощью субстрата хромогена, изменяющего окраску под действием фермента.