новая папка / Лекция 5 (2) ИММУНКА-4

3

1.5. Р-ции с использованием меченых антител или антигенов.

РИФ (метод Кунса)

Различают прямой, непрямой, с комплементом – три разновидности метода.

Реакция Кунса является методом экресс-диагностики для выявления антигенов микробов или антител.

Прямой метод РИФ – антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, светятся в УФ – лучах люминисцентного микроскопа в виде каймы.

Непрямой метод РИФ – комплекс антиген – антитело выявляется с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагн. сыворотки. Несвязавшиеся антитела отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образ. комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромами. Наблюдают в люминисцентном микроскопе (рис.13.10, стр.290).

1.6. ИФА

Выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, коньюгированных с ферментом – меткой (пероксидазой хрена, бета – галатозидазой или щелочной фосфатазой).

После соединения антигена с меченной ферментом имм. сывороткой в смесь добавляют субстрат – хромоген. Субстрат расщепляется ферментом, и изменяется цвет продукта реакции – интенсивность окраски прямо пропорциональна кол-ву связавшихся молекул антигена и антител.

Твердофазный ИФА – наиболее распространен. вариант ИФА, когда один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитела) сорбирован на твердом носителе (н., в лунках планшеток из полистерола).

При определении антител в лунки с антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом, и субстрат (хромоген) для фермента. После каждого добавления лунки промывают.

При положительном результате изменяется цвет р-ра хромогена. Твердофазный носитель можно сенсибилизировать и антителами. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку, меченную ферментом и субстрат для фермента.

Конкурентный вариант ИФА: искомый антиген и меченный ферментом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки. Другой тест – искомые антитела и меченные антитела конкурируют друг с другом за антигены.

ИФА применяют для диагн. вирус., бакт.и паразитарных болезней (гепатит В, ВИЧ и др). Опред. гормоны, ферменты, лекарства и др.б.а.в. в минорных концентрациях – 10^-10 : 10^-12 г/л.

1.7. РИА

В реакции антиген – антитело применяют меченные радионуклиды. После взаимодействия отделяют радиоактивный иммунный комплекс и опред. его радиоактивность в счетчике: интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.

Варианты РИА: твердофазный вариант РИА и конкурентный РИА.

Метод экологически опасен.

РИА применяют для определения антигенов микробов, иммуноглобулинов, б.а.в. в минорных количествах.

1.8. Иммуноблоттинг – высокочувствительный метод, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА.

Антиген выделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят его (блот – пятно) из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА.

Фирмы выпускают полоски с блотами антигенов, на которые наносят сыворотку больного. После инкубации отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс антиген + антитело больного + антитело против Ig человека выявляют добавлением субстрата хромогена, изменяющего окраску под действием фермента (рис.13.13., стр.292).