книги из ГПНТБ / Иваницкий Г.Р. Исследование микроструктуры объектов методами когерентной оптики

Взаимодействие таких независимых потоков от различных точек Поля препарата может быть охарактеризовано как аддитивное в от­ ношении амплитуд (при когерентном освещении) или в отношении интенсивностей (при некогерептном освещении).

Весьма существенным при использовании методов оптимального обнаружения является вопрос о стационарности и законе распреде­ ления амплитуд шумового фона изображении.

Стационарным в широком смысле слова будем называть ми­ кроскопическое поле, в котором:

1) соблюдается постоянство математического ожидания функции, описывающей распределение интенсивности в атом ноле:

Mfff.v, //)] = const;

2) сохраняется постоянной величина дисперсии указанной функ­

ции

/у)— //)]}■ = const;

3)корреляционная функции зависит лишь от величины разности текущих координат, по не зависит от самих координат

к I, может быть заменено усреднением по координатам, то для рас­ сматриваемой совокупности микроскопических полей зрения выпол­ няется условие эргодичности

М If (*■ У)] = jim - j- Ц / (х. у) dx dy,

где S — область усреднения.

Рассмотрим условия, выполнение которых необходимо для со­ блюдения стационарности рассматриваемых двумерных функций. В биологии нарушения стационарности связаны как с методическими погрешностями, так и самой природой анализируемых препаратов.

Методические погрешности, приводящие к нарушению стационар­ ности, определяются разной толщиной приготовляемых для анализа срезов, неоднородностями фиксации и заливки, нарушением чистоты красителя и условий окрашивания (изменением pH, продолжитель­ ности и пр.), выцветанием красителя и некоторыми менее существен­ ными факторами (Л . 20, 28, 70].

Изменения параметров биологических препаратов приводит к изменениям статистических моментов. Например, увеличение объ­ ема гистологических препаратов при фиксации и заливке приводит к увеличению средней плотности и соответственно к уменьшению математиечского ожидания (при измерении пропускания).

Если характер препаратов таков, что изменяется лишь матема­ тическое ожидание, это еще не говорит о нарушении стационарности, поскольку центрирование рассматриваемых случайных процессов попрежнему позволяет применять методы анализа стационарных функ­ ций. Использование когерентных оптических систем для анализа ми-

70

кропзображений позволяет производить центрирование достаточно простыми средствами: путем блокирования в спектральной плоскости участка, соответствующего нулевым пространственным частотам.

Однако, если методические погрешности приготовления препара­ тов могут быть сведены к минимуму, нарушения стационарности, связанные с самой природой биологической структуры, неустранимы. Устойчивость статистических параметров распределений при условии их стационарности определяется протяженностью анализируемых полей. С увеличением этой протяженности эффективность статисти­ ческой оценки увеличивается, а среднеквадратичная погрешность оценки уменьшается.

Так, нарушение стационарности может быть связано с опреде­ ленным функциональным состоянием части клеточной популяции, вызывающим изменения интенсивности окраски. В работе }Л . 14]

и биологической специфики анализируемых объектов. Например, од­ ним из авторов (Л . 40] исследовались статистические характеристики давленых препаратов корешков Vicia faba структур, удобных для анализа хромосомных повреждений. Препараты готовились по стан­ дартной методике. Четырех-пятисаптиметровые корпи подвергались облучению, после чего фиксировались в фиксаторе Карнуа. Гидролиз Д Н К производился в холодной, а затем в подогреваемой соляной кислоте. После воздействия реактива Шиффа корешки помещались для размягчения в 45% -ную уксусную кислоту. Раздавливались ко­ решки с помощью специальных приспособлений и с соблюдением нужного соответствия между твердостью корешка и необходимым усилием, что обеспечивало вполне удовлетворительную однородность

па вход амплитудного анализатора АН-100. Полученные гистограммы регистрировались на бумажной ленте. На Э Ц ВМ «Минск-22» рассчи­ тывались первые четыре момента функции плотности вероятности распределения амплитуд: математическое ожидание, дисперсия, асим­ метрия, эксцесс.

Анализ пр.опзводплся на произвольно выбранных участках пре­ паратов. Для оценки степени стационарности исследуемых распре­ делений рассчитывались также математическое ожидание, диспер­ сия, срсднеквадратпческое отклонение и коэффициент вариации рас­ пределений выборочных значений математического ожидания, дис­ персии, коэффициентов асимметрии и эксцесса функции плотности вероятности распределения амплитуд.

Анализ показал, что на коэффициент вариации основных ста­ тистических характеристик особое влияние оказывают методические погрешности, связанные с приготовлением препаратов. Так, изме­ нение средней интенсивности окраски, приводящие к изменениям математического ожидания распределений, связывается с продолжи­ тельностью гидролиза ДНК. и температурой, при которой он про­ исходит, а также с качеством реактива Шиффа. Расфокусировка препарата в анализируемом поле зрения приводит к уменьшению среднего контраста изображения и соответственно к уменьшению ди­ сперсии D и среднеквадратичного отклонения а. Однородность пре­

71

парата зависит от способа раздавливания корешков п от их жестко­ сти, которая определяется продолжительностью пребывания в фик­ саторе и в уксусной кислоте.

Все указанные погрешности при тщательном контроле за методи­ кой приготовления препаратов могут быть существенно уменьшены.

При измерении серии препаратов получены средние значения коэффициентов вариации статистических моментов от 4 до 15% при

чаев гипотезу .нормальности можно считать правдоподобной с ве­ роятностью, не меньшей 0,8.

Вероятность ошибки при обнаружении биообъектов во многом определяется априорной информацией о структуре фона. При синтезе согласованных фильтров учет спектральных характеристик фона обязателен. Обыч­ но для этих целей используют энергетический спектр фона. Если обозначить S(co.v, шу) спектр заданного рас­ пределения плотности, то энергетический спектр будет

Функция (123) может принимать только положитель­ ные значения, поэтому она реализуется на фотопластин­ ке заданным распределением интенсивности. При фильт­ рации эта пластинка соединяется с голограммой Фурье эталонного изображения, содержащей функцию, ком­ плексно сопряженную спектру эталона. Обе пластинки помещаются в частотную'плоскость оптической системы. Измерение спектральной плотности фона производится в оптической системе, выполняющей преобразование Фурье, выходная плоскость которой анализируется фото­ электрическим детектором [Л. 118]. Смещенность и сте­ пень сглаживания оценки спектральной плотности фона зависят от протяженности вводимых в коллимирован­ ный пучок входных распределений, а также от размеров и формы сканирующей диафрагмы в выходной плоскости.

15.ОБНАРУЖЕНИЕ ОБЪЕКТОВ СЛУЧАЙНОЙ ФОРМЫ

Вбольшинстве задач микроскопического анализа геометрическая структура объектов, составляющих попу­ ляцию, может варьировать достаточно широко.

72

Решение задачи об обнаружении с помощью методов двумерной согласованной фильтрации объектов с флюк­ туирую щей формой рассмотрено ниже на примере обна­ ружения клеток, находящихся в анафазной стадии деле­ ния. Постановка этой задачи важна при исследовании хромосомных мутаций в радиационной генетике.

В качестве первого этапа при автоматическом под­ счете аберрантных «леток необходимо осуществить опе­ рацию их обнаружения на мешающем фоне. Использо­ вать селективные методы окрашивания и другие методы, позволяющие дискриминировать фон, здесь не удается. Это приводит к использованию в подобной ситуации методы статистической теории обнаружения [Л. 75].

с существенной неоднозначностью формы. Поэтому об­ щая структура алгоритма обнаружения будет сводиться не только к отысканию максимальных значений корреля­ ционной функции по неопределенным параметрам объек­ та, связанным с переносом и поворотом, но и по пара­ метрам, определяющим неопределенность формы:

Максимум в этом случае отыскивается по совокуп­ ности j эталонных изображений, отражающих динамику изменения формы опознаваемых объектов. Эталонные изображения являются результатом статистического ус­ реднения некоторой совокупности .(класса) изображений, обладающих морфологической устойчивостью.

Геометрия контура анафазных клеток может быть весьма разнообразной, т. е. неопределенность, касаю­ щаяся формы, довольно значительна. Это разнообразие относится не только к форме отдельных структурных

ходящихся в анафазной стадии деления) благодаря ши­ рокой изменчивости формы опознаваемых объектов и благодаря конечной чувствительности фильтра к из­ менениям формы превращается в многоальтернативную

73

pnj п констатируется факт присутствия объекта, если pji>pnj и факт отсутствия объекта, если pj<pnj.

В какой-то степени значительная вариабельность при­ знаков опознаваемых объектов может быть скомпенсиро­ вана большой информационной емкостью двумерного фильтра. Число запасаемых па различных пространст­ венных несущих частотах эталонов, перекрывающих весь диапазон возможных изменении формы [Л. 37], в основ­ ном ограничено лишь шумовыми свойствами применяе­ мых фотоматериалов п апертурами используемых для обработки линз. Одна'ко чрезвычайно важно рациональ­ но использовать эту емкость. Уточнение границ классов необходимо производить, оценивая допустимость измене­ ния некоторых параметров обнаружения.

Основным критерием качества автоматического ана­ лиза мнкрообъектов является ошибка измерения, одно­ значно связанная в случае использования статистических методов с вероятностями ложного срабатывания и про­ пуска объекта. Под вероятностью ложного срабатывания понимается вероятность превышения порога выходным напряжением, полученным в результате преобразования фотоэлектрическим детектором распределения интенсив­ ностей в корреляционном поле при условии, что объекта на выходе нет:

Вероятность пропуска соответственноопределяется вероятностью того, что выходное напряжение не превы­ шает порог в случае, когда объект в анализируемом поле зрения присутствует:

Так как распределение амплитуд фона при обнару­ жении анафазных клеток подчиняется нормальному за­ кону, то можно записать:

74

Поскольку .показано [Л. 44], что случайная функция, распределенная по нормальному закону, в результате линейного преобразования типа согласованной фильтра­ ции сохраняет закон распределения, то можно утверж­ дать, что закон распределения величины р нормальный

*П

ф (z" ) = Т У j* ехР(— О У

о

в которой

р

Z 11

Ро

Чтобы определить вероятность ложных срабатываний, напишем закон распределения величины р при отсутст­ вии объекта

На рис. 11,а показана плотность распределения функ­ ции се(р [0) (в анализируемом поле зрения объект отсут­ ствует). Дисперсия шумового распределения на выходе

согласованного фильтра будет аГ =2ЕС/Ет. Если рп —

пороговое значение, то вероятность ложного срабатыва­ ния будет равна определенному интегралу от плотности

75

На рис. 11,а это соответствует заштрихованной пло­ щади под кривой ш(р|0).

При появлении объекта в анализируемом поле зрения кривая иу(р|S) смещается на величину, равную среднему

значению р. В случае, когда объект имеет детерминиро­ ванную форму, случайной составляющей во входном рас­ пределении является лишь составляющая фона. Поэтому плотность вероятностей tty (р |S) подчиняется также нор­

мальному закону с тем же значением дисперсии а~ ,

но среднее значение процесса из-за наличия объекта

изменяется и становится равным также о“ . Вероятность

правильного обнаружения при этом будет равна опре­ деленному интегралу от да(р|5) с пределами от рп до оо:

На рис. 11,6 вероятность правильного обнаружения определяется площадью заштрихованной области справа

от порога рп.

Рассмотрим более под­ робно, как влияет неопреде­ ленность формы на вероят­ ности ошибок при автомати­ ческом анализе. Согласно принятой модели микроско­ пическое изображение пред­ ставляется в виде аддитив­ ной совокупности объекта и фона. В свою очередь неоп­ ределенность формы объек­ та учитывается представле­

ного изображения и шумо­ вой составляющей

76

интегральными преобразованиями (130), (132), но в подынтегральных выражениях условная плотность ве­ роятности будет представлять плотность вероятности суммы случайных величин, соответствующих распределе­ нию интенсивности фона и шумовой составляющей изоб­ ражения объекта. Плотность вероятности суммы случай­ ных величин определяется, как известно, правилами композиции законов распределения слагаемых (Л. 10]. Учитывая, что распределения интенсивности фона и шу­ мовой составляющей объекта независимы и подчинены нормальному закону, можно утверждать, что результи­ рующее распределение тоже нормально.

■Вероятность пропуска будет определяться выраже­ нием

77

ляционной функции. Сравнение полученного распределе­ ния с теоретически нормальным распределением с теми же значениями математического ожидания и дисперсии

показывает, что распределение величины р (рис. 12), не противоречит гипотезе нормальности при доверительной вероятности 0,85. Проверка гипотезы осуществлялась по критерию х2- 'Производились прнкидочные оценки харак­ тера распределения величины р в ряде классов. Получен­ ные результаты в основном не противоречат гипотезе нормальности.

Таким образом, в пределах класса величина р рас­ пределена по нормальному закону со средним значением

рср, пропорциональным средней энергии изображения

объекта и дисперсией а!_.

р

Следовательно, при обнаружении объекта со случай­ ными флюктуациями формы, вероятность пропуска объекта будет определяться выражением

<Р<РП> (7)

Распределение амплитуд в корреляционном поле при появлении объекта описывается выражением (129).

В свою очередь согласно сказанному выше

78

где Ф(л') — интеграл вероятностей.

Воспользовавшись выражениями (127) и (138), мож­ но построить рабочие характеристики системы для слу­ чаев обнаружения объекта с флюктуирующей формой. Вероятность правильного обнаружения при этом будет определяться выражением

Вычисленная зависимость вероятности правильного обнаружения объекта с флюктуирующей формой от ве­ роятности ложного срабатывания при использовании в качестве параметра величины среднего значения сиг-

нал/шум р = ар представлена на рис. 13.

При обнаружении объектов детерминированной формы величина рс1, в формуле (139) становится р, a al_ обра­

щается в нуль. Зависимости вероятности правильного обнаружения от вероятности ложного срабатывания в этом случае представлены на том же рисунке пунктир­ ными линиями. Из рисунка видно, что наиболее ощути­ мые потери в надежности обнаружения при анализе объектов случайной формы в сравнении с анализом де­ терминированных объектов наблюдаются при соотноше­ нии сигнал/шум, не превышающем 15. При увеличении соотношения сигнал/шум различия в рабочих характери­ стиках обоих систем становятся менее заметными, хотя и здесь вероятность правильного обнаружения выше при анализе детерминированных объектов.

Несомненный интерес представляет более подробный анализ дисперсии величины р, обусловленной флюктуа.

79