книги из ГПНТБ / Иваницкий Г.Р. Исследование микроструктуры объектов методами когерентной оптики

к задаче обнаружения объекта с неполностью известны­ ми параметрами.

Интересные возможности исследования изменяющих­ ся во времени объемных микроструктур, недоступные традиционной микроскопии, демонстрируют новые коге­ рентно-оптические методы, связанные с голографической микроскопией (гл. 5).

Рассмотрение упомянутых вопросов и составляет основное содержание этой книги.

Г л а в а в т о р а я

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАРАМЕТРОВ МИКРООБЪЕКТОВ С ПОМОЩЬЮ РЕГИСТРАЦИИ ИХ СВЕТОРАССЕЯНИЯ

5. ФОРМУЛИРОВКА ЗАДАЧ

В настоящее время в практике микроскопических исследований используется свыше 50 методов анализа количества и геометрических параметров микрообъектов, находящихся в срезах, мазках или во взвешенном со­ стоянии в жидкости н газе. Больше половины этих ме­ тодов оптические. Среди них особое место занимают ме­ тоды светорассеяния.

Методы светорассеяния весьма перспективны. Основ­ ное их преимущество в применении к исследованию био­ логических объектов состоит в том, что на объекты ока­ зывается слабое световое воздействие, т. е. они слабо повреждаются. Это позволяет следить за кинетикой про­ цессов, в то время как большинство микроскопических методов являются статическими и оперируют, как пра­ вило, с мертвым, фиксированным препаратом.

Для изучения объектов неживой природы указанное достоинство не является решающим. Однако возмож­ ность получения количественного параметра, характери­ зующего сразу всю совокупность функциональных эле­ ментов, бывает также весьма привлекательной.

Исследование параметров микрообъектов с помощью изучения их светорассеяния относится к так называемым обратным задачам. Основной их особенностью является решение задачи в обратном направлении причинноследственных отношений, т. е. по изучению следствия (характера светорассеяния) восстанавливается причина (микроструктура объектов).

20

Можно утверждать, что если удалось измерить ин­ тенсивность, поляризацию и фазу световых волн, рассе­ янных мпкрообъектами по отношению к падающему свету, как функцию углов рассеяния, то согласно фор­ мальной постановке обратной задачи рассеяния [Л. 134] этой информации в принципе достаточно для получения количественного описания геометрических параметров микроструктуры объекта. Как показал французский ма­ тематик Адамар, вычислительная схема подобных задач очень чувствительна к небольшим ошибкам регистрируе­ мых данных. При обратном пересчете они приводят

кбольшим ошибкам в определяемых параметрах. Сужение общности постановки задачи, использова­

ние дополнительной информации о микроструктуре по­ зволяет регулярнзировать обратную задачу— избавить­ ся от неоднозначности в ее решении.

В настоящее время разработаны приближенные ме­ тоды расчета обратной задачи рассеяния как для микро­ объектов, размер которых меньше длины световой волны (метод Дебая [Л. 9, 73]), так и для микрообъектов раз­ мером больше длины световой волны [Л. 54, 96, 114]. Во втором случае рассеяние рассматривается как комбина­ ция дифракции, преломления и отражения.

По мере увеличения размера микрообъектов в обла­ сти малых углов основной вклад в рассеяние света начи­ нает вносить дифракция Фраунгофера [Л. 76, 100].

В дальнейшем будут рассматриваться именно этот случай светорассеяния и его практические приложения.

Введем дополнительно следующие ограничения:

1)свет, рассеянный одним функциональным элемен­ том, достигает приемника излучения, не рассеиваясь на других элементах (однократное рассеяние);

2)функциональные элементы не изменяют длины

волны облучающего их света (люминесценция объекта отсутствует);

3) микроструктура либо полностью упорядоченная (решетка), либо полностью хаотическая (случайно рас­ положенные микрообъекты). Во втором случае расстоя­ ние между элементами распределено по случайному закону с нулевой корреляцией (практически это дости­ гается, когда расстояние между микрообъектами в 4 — 5 раз больше их среднего размера [Л. 9]). Последнее дает возможность пренебречь межэлементной деструк­ тивной интерференцией, что в свою очередь позволяет

21

Jli

Рис. 2. Дифракция Фра­ унгофера.

а — схема формирования: // — источник света, Л\ — линза конденсора, Пл\—пло­ скость расположения экрана с диафрагмами; Л2 — линза объектива, Лл2 — плоскость расположения экрана с «вто­ ричным изображением»; б— изображения экрана с диа­ фрагмами.

го типа объектов, можно получить, регистрируя мало­ угловое светорассеяние.

Допустим, что на некоторый объект, представляющий собой экран в плоскости Пл{, имеющий N отверстий, па­ дает плоская волна (рис. 2,о). Определим, как будет выглядеть дифракционное изображение в плоскости Плъ полученное в результате интерференции прошедших че­ рез отверстие волн. Будем рассматривать дифракцион­ ную картину Фраунгофера в фокальной плоскости линзы.

Введем координатные сетки — одну общую для всего экрана в плоскости Плу и индивидуальные с началом

23

Если апертура оптической системы достаточно вели­ ка (т. е. ее влиянием можно пренебречь) н система ли­ нейна, то для когерентного освещения справедливо вы­ ражение, описывающее двумерный спектр объекта:

Множители, содержащие Хе и Yg, можно вынести за знак интеграла. Тогда получим:

N

Зоб.а К > шу) = £ ехр [— j (шхХе -f- ШуУг)] X £=1

+00

Х^ Л об(л'', y')exp\—j(wxx'-\-a>,jy')]dx'di/. (19)

—оо

Если обозначить

сящего только от свойств отдельного элемента, на кото­ ром происходит дифракция (щель млн отверстие, ампли­ тудный или фазовый элемент и т. п.), и множителя q= = UU*, который зависит от расположения элементов друг относительно друга. При рассмотрении дифракции рентгеновских лучей на кристаллической решетке пер­ вый из этих множителей обычно называют фактором рассеяния, а второй — структурным фактором.

Итак, спектр, получаемый от набора диафрагм, со­ стоит из двух частей: одной, определяемой формой диа­ фрагм, и другой — их взаимным расположением. Такое

24

Однако в случаях, изображенных на рис. 1, подлож­ ка прозрачна для света, а объекты поглощают свет. Воспользуемся «принципом Бабине», который связывает между собой явления дифракции света на так называе­ мых дополнительных дифракционных экранах [Л. 22].

Дополнительными экранами принято называть такие экраны, которые совместно полностью перекрывают вол­ новой фронт. Например, круглое отверстие в непрозрач­ ном бесконечном плоском экране и непрозрачный диск, имеющий такой же диаметр, что и отверстие, будут до­ полнительными экранами. Две амплитудные дифракци­ онные решетки, состоящие из прозрачных элементов равной ширины, также будут дополнительными экра­ нами.

Принцип Бабине утверждает, что при дифракции плоской волны на каждом из дополнительных экранов распределение освещенностей в дифракционных карти­ нах Фраунгофера, полученных в этих двух случаях, оди­ наково всюду, кроме того места, где расположено иде­ альное оптическое изображение источника света, т. е. в области нулевых пространственных частот.

Таким образом, из изложенного следует, что дифрак­ ционная картина, создаваемая большим числом беспоря­ дочно распределенных круглых диафрагм, совпадает с дифракционной картиной, найденной для одной круг­ лой диафрагмы, и состоит из яркого центрального пятна, окруженного рядом чередующихся светлых и темных ко­ лец. Согласно принципу Бабине такой же вид имеет (за исключением очень малой области в центре) дифракци­ онная картина, создаваемая рядом беспорядочно распре­ деленных темных экранов.

Дифракционная картина от круглого объекта показа­ на на рис. 3,щ б. Она представляет собой яркое пятно, окруженное чередующимися темными и светлыми коль­ цами. Значения радиусов светлых и темных колец при­ ведены в таблице, где указаны также величины макси­ мальной освещенности. Яркость всех колец, за исключе­ нием центрального, очень невелика. Расчет показывает, что 84% всего света сосредоточено в центральном пятне.

Полученный выше результат можно использовать для измерения диаметра маленьких частиц, например эри­ троцитов (рис. 1,а). Простое приспособление для прове­ дения такого опыта легко изготовить пз металлической пластинки, просверлив в ней 12 отверстий диаметром

2G

щают непосредственно перед глазом наблюдателя. Роль точечного источника (рпс. 2,а) в этом случае играет центральное отверстие в металлической пластине, роль

центральное отверстие, окруженное рядом светлых и темных колец. Изменяя расстояние между глазом и пре­ паратом, можно совместить одно из этих колец с ок­ ружностью, заданной маленькими отверстиями. Если измерить затем расстояние до пластины, то можно опре­ делить диаметр частиц на предметном стекле при помо­ щи таблицы. Такое устройство называется эриометром Юнга.

Диаметры эритроцитов каждого человека не вполне одинаковы, а распределены около среднего значения, что уменьшает резкость дифракционных колец. Коэффициент вариации примерно равен 8%. Однако даже с учетом этого обстоятельства результаты измерений диаметра данного кольца при работе с одним препаратом воспро­

27

изводимы с точностью до 3%, что позволяет заметить возникающие отклонения среднего диаметра эритроцитов от нормы.

Теперь этот метод практически не применяется, так как существуют гораздо более точные способы измере­ ния эритроцитов: кондуктометрические [Л. 56] или теле­ визионные [Л. 27]. Однако еще в 50-х годах этим спосо­ бом измерения пользовались на практике [Л. 68].

Рассмотренные в этом параграфе объекты состояли из функциональных элементов круглой формы с хаоти­ ческим расположением на плоскости. Для исследования объектов другой формы необходимо воспользоваться некоторыми дополнениями к изложенному выше методу, которые будут рассмотрены в § 8. Предварительно не­ обходимо выяснить, как влияют на двумерный спектр геометрические преобразования объекта.

7. ХАРАКТЕР ИЗМЕНЕНИЯ СПЕКТРА ПРИ НЕКОТОРЫХ ПРЕОБРАЗОВАНИЯХ ОБЪЕКТА

Как известно, основные преобразования плоских фи­ гур в декартовой системе координат могут быть записа­ ны в следующей форме:

параллельный перенос

где х и у — координаты точек фигуры, подвергаемой преобразованиям; х' и у' — координаты точек новой фи­ гуры, полученные в результате преобразования; т — ко-

28

+ /щу, имеет спектр |.b|-Si(coX со^), причем со'х= 11(£>х+ + ксоу, ®'у= 1з<йх+'к<йу [Л. 11]. Коэффициенты т, опреде­ ляющие преобразование координаты точек объекта во входной плоскости Пя 1 (рпс. 2,а), образуют матрицу М, транспонированную с матрицей, обратной матрице L, образованной коэффициентами /, определяющими преоб­ разованные координаты точек спектра в частотной плос­

Изменение интенсивности спектральных составляю­ щих определяет якобиан преобразования |П|, вычисляе­ мый как определитель матрицы

При линейном преобразовании координат якобиан преобразования представляет постоянную величину

Иconst-

Рассмотрим характер изменения спектра в случае преобразований объекта на основе выражений (23) — (25).

При. параллельном переносе функция fi(x', у'), имею­ щая спектр 5 i (mv, coy), принимает вид fz(x+Ах, у+Ау).

Спектр такой преобразованной функции +оо

X ехР [—/ (»** + “ у!/)] dx dy.

Вводя новые переменные интегрирования х' = х+Ах, У'— У+Ау, получаем:

+со

X (<вл.,Шу) = ) J| f, (X', у’) ехр [— / К л ' + (ОуУ')\ X

29