книги из ГПНТБ / Иваницкий Г.Р. Исследование микроструктуры объектов методами когерентной оптики

лярпзацпи анализатора и поляризатора, называемом скрещенным, свет на выходе микроскопа отсутствует. Попадание в поле зрения микроскопа объекта, обладаю­ щего поляризующими свойствами, приводит к локаль­ ному изменению пространственной ориентации световой волны, за счет чего мнкрообъект на выходе будет выгля­ деть светлым на темном фоне.

Можно гозорнть и о некоторых других признаках, используемых для выделения микроскопического эле­ мента из окружающей среды, например использования различий в электрической проводимости, получивших название электрического контраста [Л. 56, 86], электро­ форетических методов [Л. 2] н некоторых других.

В последнее время появились сообщения о разработ­ ке селективных методов контрастирования и в электрон­ ной микроскопии [Л. 81]. Но количество веществ, кото­ рые можно таким образом выделить, пока ограничено.

Несмотря на относительное совершенство в анализе амплитудных, фазовых, частотных и поляризационных изменений световых колебаний, прошедших препарат, достигнутое в микроскопической технике, процесс авто­ матического обнаружения или выделения микрообъек­ тов на сложном шумовом фоне не может быть решен использованием лишь описанных выше традиционных методов. Несомненно, что только наличие специфических реакций в отношении опознаваемых структур позволяет достаточно надежно классифицировать совокупность объ­ ектов сравнительно простыми методами. Например, в большинстве из известных нам задач автоматического анализа микрообъектов идентификация объекта осуще­ ствлялась введением амплитудной (а иногда и времен­ ной) селекции электрических сигналов, полученных в ре­ зультате преобразования фотодетектором световой энер­ гии в электрическую [Л. 61, 77, 97]. Естественно, что та­ кое решение требует селективных методов окрашивания, что ограничивает применимость автоматических методов. Действительно, признаков, по которым бы объект абсо­ лютно отличался от фона, в большинстве реальных слу­

чаев указать нельзя.

Можно назвать множество задач, в которых любой из перечисленных выше признаков (абсорбция, измене­ ние фазы, люминесценция, поляризация) присущ в той или иной степени и объекту и фону. Поэтому, говоря строго, задача обнаружения или выделения изображе­

10

ния микрообъектов носит вероятностный характер. На­ ряду с широким применением оптико-электронных ска­ нирующих систем, использующих традиционные оптиче­ ские методы идентификации микрообъектов, в последнее время стали также использоваться новые когерентные оптические методы.

4.КОГЕРЕНТНЫЕ ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

а) Линейность оптической системы

Используемые методы описания формирования изо­ бражения микрообъекта справедливы только в случае применения линейной оптической системы. Поэтому об­

нием и пропусканием света препаратом. Исследование этого распределения дает возможность говорить о струк­ туре объекта. В оптико-электронных системах распреде­ ление яркости на объекте вначале преобразуется опти­ ческой системой в изменение освещенности, а затем электронной системой >в изменения тока. Как правило, эти преобразования выполняются с некоторыми мас­ штабными коэффициентами. Одиако, чтобы преобразо­ вание было линейным, не зависящим от аргументов изображения, необходимо выполнение двух условий.

Первое условие— это сохранение пропорционально­ сти между входом и выходом системы.

. При изменении в некоторое количество раз входного воздействия выходной отклик системы должен изменить­

afBx(x, у) должна воспроизводиться функцией afBHX(x, у). Таким образом, первое условие требует, чтобы гра­ фик, иллюстрирующий зависимость выхода оптико-элек­ тронной системы от ее входа, был прямой линией. Со­ блюдение этого условия является следствием выполне­ ния принципа суперпозиции в линейной системе. Следует учесть, однако, что электронная система может быть линейной лишь относительно интенсивностей (квадратов амплитуд) светового потока (так как любой фотодетектор является квадратичным), в то время как оптическая система может быть линейной как относи-

11

тельно амплитуд (при когерентном освещении), так и относительно интенсивностей (при некогерентном осве­ щении) .

Второе условие требует сохранена инвариантности, т. е. выходная функция не должна менять своей формы при изменении начала отсчета. Для оптической части системы это предполагает отсутствие зависимости ха­ рактера изображения от его перемещения в плоскости

всех оптических систем вследствие зависимости величи­ ны аберраций от угловых координат. Инвариантность соблюдается в системах, где аберрации достаточно мало изменяются по полю, т. е. в нзопланатическнх системах, или внутри центральных зон оптических систем (такие зоны называются пзопланарными). Поскольку с по­ мощью сканирования электронная система преобразует функцию яркости двух аргументов (координат х, у) в функцию единственной переменной — времени, условие инвариантности для электронной системы требует неиз­ менности ее характеристик во времени. Если / Ux(0 обу­ словливает /пых(О. то /пх('^+т) будет обусловливать

/вых (t + т) ■

Линейные системы интересующего нас класса описы­ ваются линейными дифференциальными уравнениями с постоянными коэффициентами. Решениями являются зависимости, устанавливающие связи между входами и выходами систем. Лишь сравнительно недавно такой ме­ тод анализа, хорошо известный в теории связи, стал ис­ пользоваться для исследования оптических систем [Л. 72, 89, 90]. Распределение интенсивности в изобра­ жении микрообъекта, которое может рассматриваться как выходная функция линейной оптической системы, представляется интегралом свертки

сти объекта; h„(x—Х\, у— уУ) — аппаратная функция или функция рассеяния. Аппаратная функция описывает распределение света в плоскости изображения (х, у) при наличии в плоскости объекта (,vb у\) точечного нсточни-

12

ка. Под точечным источником подразумевается входное воздействие, интенсивность которого описывается дель­ та-функцией 6(Х) yi):

для х, у ф 0;

для х — у—0;

+ СО

— СО

Аппаратная функция или отклик системы на точеч­ ный источник полностью характеризует поведение си­ стемы.

Интегральная форма зависимости (3) получена на основе принципа суперпозиции путем суммирования эле­ ментарных откликов. Условие инвариантности требует, чтобы характер функции рассеяния не изменялся при перемещении точечного источника в плоскости объекта. Это условие выполняется в изопланатнческих системах или изопланарных областях системы.

Однако, кроме аберраций, на аппаратную функцию влияет также положение сигнала во входной плоскости вследствие появления эффекта виньетирования [Л. 15], связанного с конечной апертурой используемых линз. Это ограничивает не только положение, но и размеры анализируемых распределений на входе [Л. 123].

Применение методов Фурье-анализа к оптическим системам требует дифференциации случаев когерентного и некогерентного освещения.

б) Пространственная и временная когерентность

Согласно волновым представлениям микроскопиче­ ское изображение является результатом дифракционных и интерференционных явлений. Основные характеристи­ ки микроскопа (разрешающая способность, величина аберраций и др.) не могут быть рассмотрены без опре­ деления степени когерентности световых воли, т. е. без анализа фазовых отношений в поле излучения. Этому способствует то обстоятельство, что в микроскопии ис­ следованию подлежат (за исключением анализа люминесцирующих объектов) несамосветящиеся объекты, а степень когерентности можно изменять регулируя про­ тяженность освещающего источника.

Дискретная природа излучения света является при­ чиной мгновенных изменений фазы световой волны

13

(речь идет о спонтанном излучении), примерно, каждые 10-8 с. Излучение может считаться когерентным, если оно получено от точечного монохроматического источни­ ка (соблюдение требования пространственной когерент­ ности) при условии, что разность оптических путей к выбранной точке пространства такова, что не создает временных задержек более чем 10~8 с (соблюдение тре­ бования временной когерентности) [Л. 85].

В микроскопических системах степень когерентности освещения при использовании некогерентных источников зависит от соотношения апертур объектива и конденсо­

объекта, освещенную центральным максимумом диф­ ракционной картины точечного источника, построенной конденсором в плоскости объекта. В центральном максимуме дифракционной картины точечного источника световые колебания, как известно, синфазны.

Хорошим приближением к когерентному освещению является метод освещения по Кёлеру [Л. 52]. Увеличение протяженности источника (раскрытием ирисовой диа­ фрагмы конденсора) приводит к повышению степени некогерентности освещения.

При использовании в качестве источника оптического квантового генератора (ОКГ) пространственная коге­ рентность соблюдается по всему сечению луча при ге­ нерации продольных колебаний н оказывается ограни­ ченной при возбуждении поперечных колебаний. Селек­ ция разных видов колебаний может осуществляться подбором определенной конфигурации оптического резо­ натора. Временная когерентность определяется степенью монохроматичности (шириной полосы) генерируемых ко­ лебаний.

Система, использующая некогерентное освещение, линейна относительно интенсивностей и для нее спра­ ведливо выражение (3).

В случае использования когерентного излучения ре­ зультирующее воздействие получается суммированием не интенсивностей, а амплитуд. Когерентная система оказывается линейной относительно амплитуд и нели­ нейной относительно интенсивностей. Зависимость, :вяяывающая вход и выход в когерентных системах, будет

И

такой:

+00

изображений х, у, А0б(хь у\) — распределение амплитуд в плоскости объекта Хь г/г, ha(x—xit у—у д — аппарат­ ная амплитудная функция системы.

Между 1гя(х—Хь у—Уд и hn{x—xit у—уд существует

Таким образом, уравнения (3) и (4) являются основ­ ными уравнениями, описывающими формирование изо­ бражения в линейной оптической системе. Поскольку представляет интерес не только функции, описывающие распределение яркости на объекте, по и ил спектры, це­ лесообразно перейти к спектральному описанию указан­ ных явлений. Это можно сделать с помощью прямого преобразования Фурье.

в) Преобразование Фурье в оптических системах

Согласно теореме о спектре свертки [Л. 50] спектр свертки (3) выражается произведением спектров сверты­ ваемых функций. Другими' словами, преобразование Фурье свертки равно произведению преобразований свертываемых функций. Таким образом (для некогерент­ ного освещения):

Нп(ах, ш„ ) — двумерная частотная характеристика опти­ ческой системы, являющаяся преобразованием Фурце

15

могут быть переписаны с заменой индексов интенсивно­ стей на индексы амплитуды

Таким образом, согласно (12) распределение интен­ сивностей в выходном изображении является функцией двумерного спектра исследуемого объекта и двумерной частотной характеристики используемой системы.

Другими словами, изображение микрообъекта пред­ ставляется в виде предела суммы элементарных прост­ ранственных гармонических составляющих, частоты ко­ торых одинаковы для любых изображений [интегрирова­ ние в (12) ведется в бесконечных пределах]. При этом амплитуды и фазы выбраны таким образом, что их сум­ ма представляет анализируемое изображение. Спектр показывает вклад в эту сумму каждой гармонической составляющей. Система, используемая для анализа ми­ крообъектов, переносит каждую гармоническую состав­ ляющую из плоскости объектов в плоскость изображений с множителем Я (со*, <оу).

Так как Я (со*, соу) определяется аппаратной функ­ цией системы (9), детальный анализ двумерной частот­ ной характеристики системы может быть проведен при решении задачи о дифракции света от точечного источ­ ника [Л. 26]. В случае, когда такой путь осложнен чрез-

16

мерными трудностями, имеется возможность определить двумерную частотную характеристику системы по степе­ ни деформации выходного волнового фронта [Л. 50].

Поскольку функция, описывающая распределение ин­ тенсивности света на объекте, может меняться произ­ вольно от точки к точке, ее точное аналитическое описа­ ние иногда затруднено. В этом случае образование изо­ бражений можно описывать, пользуясь методами теории случайных процессов.

Достаточно полно процесс образования изображений будут характеризовать двумерная корреляционная функ­ ция К(х', у') и двумерный энергетический спектр G(co.v, он,). Корреляционная функция для двумерного случая определяется выражением [Л. 50]

+ СО

К (х ', у') = lim - М Г / (х, у) J(х — х ', у — у') dx dy. (13)

Л'-»00 ХУ J J f/->0O —00

Энергетический спектр, согласно теореме Винера — Хинчина, представляет преобразование Фурье от функ­ ции корреляции

При образовании изображения в микроскопе за счет явлений дифракции происходит естественное разделение волн, дифрагированных на различных пространственных структурах. Угол, под которым свет дифрагирует на объекте, пропорционален отношению Х/р, где X— длина волны используемого излучения, а р — период простран­ ственной структуры.

При освещении препарата параллельным монохроматичным пучком света (когерентное освещение) про­ исходит разделение падающей волны на ряд волн, откло­ ненных под различными углами. Дифрагированные пре­ паратом пучки света концентрируются объективом в его

U \ЛТ А П I-

ничивающая попадание в микроскоп лучей, дифрагиро­ ванных под углами, большими определенной величины, по существу и определяет характер двумерной частот­ ной характеристики Н(юх. шу) микроскопической си­ стемы при когерентном освещении.

Каждая точка задней фокальной плоскости объекти­ ва связана с определенным направлением дифрагиро­ ванной волны, а интенсивность световой энергии в этой точке отражает удельный вес соответствующей прост­ ранственной частоты в формировании изображения. Про­ странственные частоты со* и (о„, имеющие размерность радиан па единицу длины, связаны с переменными £, и ц плоскости спектра, имеющими размерность единиц дли­ ны, соотношением

света.

Таким образом, при освещении объекта, находящего­ ся в передней фокальной плоскости объектива, парал­ лельным пучком света оптическая система осуществляет в задней фокальной плоскости операцию, описываемую двумерным преобразованием Фурье [формула (7)]. Эта плоскость, названная Аббе плоскостью «первичного изо­ бражения» ■[Л. 52], является плоскостью двумерного спектра изображения объекта.

Элементарные световые волны, вышедшие из каждой точки этой плоскости, интерферируют между собой во всем пространстве, находящемся за объективом, и обра­ зуют в плоскости, сопряженной с плоскостью объекта, изображение его, названное Аббе «вторичным изобра­ жением». Таким образом, между «первичным» и «вто­ ричным» изображением объекта существует зависимость, описываемая обратным преобразованием Фурье (12).

г) Краткая характеристика рассматриваемых в книге методов

Использование когерентного излучения при анализе микроструктур позволяет производить как интегральную оценку геометрических параметров совокупностей функ­ циональных элементов, так и индивидуальное исследо­ вание каждого из них.

18

Возможность сравнительно простого получения ди­ фракционных спектров от целых ансамблей микроскопи­ ческих объектов и дальнейшей интерпретации этих спек­ тров с целью определения параметров объектов делает использование когерентных оптических систем чрезвы­ чайно привлекательным в микроскопическом анализе (гл. 2). Эти методы весьма эффективны в световой ми­ кроскопии, особенно для исследования изменения пара­ метров совокупности микрообъектов. Их также можно использовать для анализа электронномикроскопических изображений. Ограничивающим условием в этом случае является требование к достаточной однородности функ­ циональных элементов в исследуемом ансамбле.

При автоматической идентификации отдельных ми­ крообъектов в тех случаях, когда отсутствуют достовер­ ные различия в характеристиках объекта и фона, целе­ сообразно использовать статистические методы обнару­ жения. При определенных допущениях о статистической структуре фона и объекта эту задачу могут выполнять устройства двумерной согласованной фильтрации (гл. 3, 4). В этом случае анализу подлежат поля зрения срав­ нительно небольших размеров и обнаружение ведется «поэлементно», т. е. в расчет принимается каждый из мнкрообъектов.

Согласованная фильтрация представляет собой один из методов оптимальной обработки информации в смыс­ ле максимизации отношения сигнал/шум. Поэтому ана­ лизируемые изображения могут быть достаточно «за­ шумлены», т. е. представляющие интерес функциональ­ ные элементы могут маскироваться мешающим фоном или другими элементами.

Обсуждаемые в литературе методы применения дву­ мерной согласованной фильтрации для анализа изобра­ жений связаны, как правило, с обнаружением сигналов детерминированной формы (буквы, отпечатки пальцев). Специфические особенности приложения этих методов к анализу изображений микрообъектов, в частности био­ логических, почти не рассматривались.

Основной особенностью применения указанных мето­ дов для обнаружения бномикрообъектов является широ­ кая изменчивость их признаков. Случайные положения и ориентация объекта в поле зрения микроскопа, а так­ же случайный характер изменения его формы фактиче­ ски сводят любую из задач автоматического анализа