книги из ГПНТБ / Инструментальные методы анализа функциональных групп органических соединений

70 Глава 1

величины химического сдвига от величины константы Гамметта оказалась линейной. Также линейной была зависимость сдвига для орго-замещенных фенолов от величины константы Тафта для различных заместителей. Анализу по описанному методу могут мешать альдегиды и такие примеси, как вода и кислые вещества, которые вступают в реакцию обмена с фенольной гидроксильной группой, изменяя тем самым величину химического сдвига.

Ранее аналогичное исследование провели Линдеман и Никсик [8 6 ] . Они ацетилировали гидроксильную группу хлорангидридом уксусной кислоты и регистрировали спектр, обусловленный метильным радикалом в ацетатной группе. Были получены интег­ ральные спектры, однако наблюдалось некоторое наложение ли­ ний. Хотя число протонов в метальной группе в три раза больше, чем в гидроксильной, однако превращение в ацетат связано с ограничениями вследствие пространственных затруднений. Для фенольных соединений определили отношение орто/пара-изомеров. Исследовали о-, м- и /г-крезолы, о-, м- и n-этилфенолы, а также о- и п-втор-бутилфенолы. Из других алкилфенолов исследовали гептил-, октил-, нонил-, децил-, С15—С2о- и полипропиленфенолы.

Еще один метод с превращением в производное описал Лидер [87] . Этот метод имеет практическое значение, но в нем исполь­ зуется спектроскопия ЯМР на ядрах 19F. С его помощью опреде­ ляли такие фенолы, как гидрохинон, резорцин, о- и п-крезолы, 2-хлорфенол, 4-хлорфенол и 4-хлор-З-метилфенол. Значения хими­ ческих сдвигов для этих фенолов находились в интервале 2,65— 2,73 млн-1 относительно аддукта гексафторацетона и воды.

Для определения положения функциональной группы Баллантин и Пиллингер [88] использовали влияние заместителей на вели­ чины химических сдвигов для протонов кольца. Диамагнитный и парамагнитный эффекты дают возможность анализировать неиз­ вестные полизамещенные фенолы.

V.РАДИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Д. Кэмпбелл

Почти все радиохимические методы определения алифатиче­ ских гидроксильных групп основаны на этерификации этих групп мечеными ангидридами кислот и хлорангидридами. При опреде­ лении микро- и полумикроколичеств соединений с гидроксильными группами, в особенности стероидов и стеринов, присутствующих в биологических жидкостях, большое значение имеют радиохимиче­ ские методы с использованием двух радиоактивных изотопов. Для выделения производных в этих методах широко применяют хрома­ тографию. Макроколичества многих соединений можно определять, комбинируя методы меченого реагента и изотопного разбавле­

ния. При определении фенолов хорошие результаты дают такие реагенты, как диазометан-14С и радиоактивные изотопы галогенов.

А. ПРЕВРАЩЕНИЕ В АЦЕТАТЫ

Как радиоактивный реагент (радиореагент) для определения первичных и вторичных гидроксильных групп уксусный ангидрид имеет много преимуществ. В пиридине реакция ангидрида (в из­ бытке) с этими группами протекает быстро и часто количественно при комнатной температуре; при повышенных температурах мож­ но обеспечить по существу полную этерификацию. Избыток ангид­ рида можно удалить путем гидролиза и последующей экстракции водным раствором щелочи или с помощью хроматографического разделения. Полученное соединение можно метить как изотопом 14С, так и тритием, что особенно ценно при использовании метода с двумя изотопами. При этом для реагентов, меченных тритием и изотопом ,4С, можно получить удельные активности более 2 Ки/мМ (кюри на миллимоль) и до 0,1 Ки/мМ соответственно, что обеспе­ чивает высокую чувствительность метода. Помимо этого с помощью перегонки полученное соединение можно легко отделить от неле­ тучих примесей. Меченый уксусный ангидрид является ценным реа­ гентом для определения стероидов и стеринов в микро- и макро­

широко используют в определениях стероидов и стеринов, содер­ жащихся в экстрактах биологических жидкостей, путем ацетили­ рования гидроксильных групп этих соединений. Концентрации этих соединений в таких экстрактах очень низки, так что в пробе

всех трех типов. Кроме ожидаемых трудностей из-за различий в реакционной способности, обусловленных этими тремя типами гидроксильных групп, анализ таких соединений затрудняют и зна­ чительные различия в скорости ацетилирования вторичных гидро­ ксильных групп, которая зависит от положения такой группы в молекуле [89]. Поскольку в анализируемых образцах содержатся лишь микроили полумикроколичества соединений с гидроксиль­ ными группами, для их определения лучше всего подходят методы с использованием двух радиоактивных изотопов. Один — сравни­

соединения, степень превращения и чистоту продукта. Сравнитель­ ный изотоп всегда находится в ангидриде, которым обрабатывают

С точки зрения синтеза практически более полезным представ­ ляется метод, в котором индикаторный изотоп вводится в ангид­ рид. Однако при использовании подходящего способа метки радиоактивными можно сделать и определяемые стероид или стерин. Возможность определения степени превращения по реакции с помощью меченых веществ отмечалась в ранних работах, посвя­ щенных использованию радиоизотопных методов в анализе амино­ кислот [90, 91]. Стероиды и стерины трудно количественно экстра­ гировать из биологических жидкостей; добавление к этим жидко­ стям радиоактивных субстратов в качестве индикаторов дает удобный способ измерения выхода. Если радиоактивный субстрат добавить в жидкость перед экстракцией, то по относительной ра­ диоактивности выделенного вещества можно точно оценить пол­ ные потери целевого соединения в ходе анализа, включая и по­ тери, обусловленные неполным ацетилированием. В работе [92] описано использование в таких анализах стероидов, меченных три­ тием, имеющих высокую удельную радиоактивность. Приготавли­ вали такие стероиды методом Вильсбаха. В настоящее время большое число стероидов, меченных изотопом 14С, имеется в про­ даже.

Лучше всего, чтобы меченый стероид или стерин, добавляемый в качестве индикатора в жидкость или высушенный экстракт, имел настолько высокую удельную радиоактивность, что добавляемое его количество было пренебрежимо мало в сравнении с количе­ ством определяемого немеченого соединения в данной пробе. Если же удельная радиоактивность индикаторного соединения меньше этого уровня, то необходимо учитывать как количество добавляемого индикатора, так и его радиоактивность, с тем чтобы впоследствии вычесть эти величины для корректирования получен­ ных результатов анализа. Важным преимуществом метода с ис­ пользованием меченых индикаторов, особенно ввиду различной реакционной способности гидроксильных групп, отличающихся по положению в молекуле, является то, что образование производ­ ного не обязательно должно быть количественным. Степень пре­ вращения можно, однако, определить в отдельном опыте путем добавления известного количества меченого соединения известной радиоактивности к высушенному экстракту перед ацетилирова­ нием, если при этом не будут допущены потери веществ после до­ бавления индикатора.

Если известно, что ацетилирование протекает количественно, то после обработки высушенного экстракта ангидридом, меченным сравнительным изотопом, к нему можно добавить соответствую­ щий ацетат, приготовленный из ангидрида или субстрата, мечен­ ного индикаторным изотопом, чтобы с его помощью измерять вы­ ход и чистоту. В анализе стероидов, когда данный метод приме­

няют в сочетании с хроматографией, он имеет то преимущество, что в нем нет необходимости точно знать вес добавленного мече­ ного производного, достаточно лишь знать полную радиоактив­ ность добавленных индикаторных изотопов. Более того, поскольку введение дополнительных активных групп при этом не имеет зна­ чения, соединение, применяемое в качестве индикатора, может иметь меньшую молярную удельную радиоактивность, чем та, ко­ торая требуется при"'использовании самого меченого субстрата. Возможные эффекты, возникающие при хроматографическом раз­ делении [93] в связи с применением такого метода, можно оценить, используя смесь чистых меченых производных.

Хроматографическое отделение целевого радиоактивного про­ изводного от других компонентов реакционной смеси проводили как с добавлением нерадиоактивного производного (носителя), так и без него. При использовании носителя его количество сле­ дует выбирать с учетом возможностей применяемого способа вы­ деления продукта реакции. Если метка индикаторным изотопом

где А — полная радиоактивность выделенной порции производного (мкКи); S0 — удельная радиоактивность чистого ацетатного про­ изводного (мкКи/мМ); F — доля конечного раствора пробы, под­ вергнутая разделению.

В другом способе определяют удельную радиоактивность уксус­ ного ангидрида в микрокюри на миллиэквивалент и по этой вели­ чине вычисляют количество М анализируемого соединения (в мил­ лимолях) в пробе:

число активных гидроксильных групп в молекуле.

Второй способ необходим, когда нельзя полностью этерифицировать активные гидроксильные группы субстрата без значи­ тельного разложения. Если для оценки потерь, обусловленных

74 Глава 1

неколичественными экстракцией и ацетилированием или другими причинами, применяется метод с индикаторным изотопом, то из величин М, вычисленных по формулам (1) и (2), вычитают соот­ ветствующие поправки. Исключительное значение в таких анали­ зах имеет метод с использованием жидкостных сцинтилляционных счетчиков, поскольку он позволяет без труда различить изотопы 14С и 3Н, используемые в качестве сравнительного и индикатор­ ного изотопов.

Ввиду, важности количественного превращения в производные был тщательно изучен процесс ацетилирования гидроксильных групп стероидов и стеринов с целью установить условия, благо­ приятствующие полной этерификации [89]. В результате выясни­ лось, что для осуществления количественного ацетилирования с образованием единственного продукта за 24 ч при комнатной тем­ пературе отношение объемов уксусного ангидрида и пиридина должно составлять 1:5. Концентрации стероидов при этом нахо­ дились в интервале 0,6—100 мкг на 0,1 мл ацетилирующего аген­ та. За исключением пространственно затрудненных третичных 17а- и вторичных 11|3-гидроксильных групп, все гидроксильные группы, обычно присутствующие в стероидах и стеринах, ацетилировались при комнатной температуре; наблюдались, однако, зна­ чительные различия в реакционной способности гидроксильных групп. В порядке возрастания реакционной способности эти группы располагались следующим образом: 3-фенол, 21-ОН, Зр-ОН, бр-ОН, 20а-ОН, 20р-ОН, 16а-ОН, вторичная 17р-ОН, вторичная 17а-ОН. Различия в скоростях реакций использовались для иден­ тификации стероидов путем селективного ацетилирования [94, 95].

Вслед за ранними сообщениями об использовании меченого уксусного ангидрида в анализах на альдостерон [96—98] этот ра­ диоактивный агент стали применять для определения гидроксиль­ ных групп стероидов и стеринов с помощью методов с единствен­ ным радиоактивным изотопом [99—104]. В большинстве своем это простые радиохимические методы. В работе [99] описано определе­ ние стигмастерина в смеси стеринов, содержащихся в сое, с ис­ пользованием уксусного ангидрида, меченного изотопом 14С, в со­ четании с прямым изотопным разбавлением. Меченый ацетат до­ бавляют при этом к смеси стеринов, которую затем подвергают ацетилированию. Радиоактивным веществом, которое выделяют и радиоактивность которого измеряют, является стигмастеринтетрабромацетат, получаемый путем обработки ацетата элементарным бромом. Изотопное разбавление меченым субстратом в качестве

радиореагента применяли при определении диэтилстильбэстрола

[105].

Еще один метод определения гидроксильных групп в стероидах ( и в других соединениях), в котором используется лишь уксусный ангидрид, меченный изотопом 14С, получил название «анализ по от­ ношению производных» [106]. В этом методе к пробе добавляют

известное количество какого-либо соединения с гидроксильными группами и затем обрабатывают ее ангидридом. Реакцию проводят

вусловиях, которые обеспечивают количественную этерификацию всех анализируемых соединений с гидроксильными группами, вклю­ чая и добавленное соединение. После этого определенное количе­ ство полученной смеси производных подвергают газохроматографи­ ческому разделению и подходящим методом измеряют радиоактив­ ность каждого из разделенных производных. По результатам этих измерений и по измеренной величине удельной молярной радио­ активности ацетилированного внутреннего стандарта вычисляют содержание в пробе определяемых соединений. Если концентрации определяемых соединений в пробе чрезвычайно малы, то для улуч­ шения разделения в смесь можно добавить некоторое количество соответствующего производного (носителя). Все производные дол­ жны полностью выходить из колонки. В качестве примера примене­ ния этого метода в работе [106] описано лишь определение тесто­ стерона с использованием метилового эфира рицинолевой кислоты

вкачестве внутреннего стандарта.

Большая универсальность двухизотопного метода определения стероидов и стеринов путем ацетилирования обусловила его более широкое распространение, чем метода с одним изотопом. Двухизотопный метод широко применялся для определений альдостерона и других стероидов в биологических жидкостях [97, 107—114]. При необходимости удалить меченые примеси часто используют хими­ ческие превращения производных. Биохимические применения одно- и двухизотопного методов подробно обсуждаются в работах

[92, 115].

Для ацетилирования веществ с первичными и вторичными гидроксильными группами применим метод с использованием ук- сусного-1-14С ангидрида в пиридине. Первоначально этот метод был предложен для определения макроколичеств ацетильных групп в продуктах реакций [116]. Устойчивые вещества этерифицировали нагреванием 1 мМ этого вещества в 1 мл безводного пиридина в присутствии 2мМ ангидрида на каждую ожидаемую гидроксиль­ ную группу. Нагревание вели в течение 4 ч при температуре 125 °С. Этерификацию соединений, разлагающихся в пиридине, можно про­ водить в присутствии ацетата натрия в качестве катализатора и без растворителя при температуре 125°С. Условия реакции не должны быть более жесткими, чем это требуется для количественного аце­ тилирования. По возможности более мягкие условия необходимы для подавления эквимолярной конденсации уксусного ангидрида с пиридином [117]. Степень этой побочной реакции сильно зависит от времени и температуры и заметно уменьшается с увеличением содержания уксусной кислоты в растворе. За исключением случая, когда меченые ацетаты разделяются с помощью газовой хромато­ графии, присутствие продукта конденсации, который не полностью гидролизуется щелочью, ухудшает точность и чувствительность

метода. При обработке уксусным ангидридом в пиридине моно- и диглицериды медленно переэтерифицируются [118], что следует учи­ тывать при анализе описанным методом проб, содержащих эфиры.

Пиридин и меченую СН3СООН удаляют путем экстракции эфир­ ного раствора продуктов реакции сначала разбавленной соляной кислотой, а затем разбавленным NaOH. Если требуется определить полное содержание гидроксильных групп в пробе, то этот способ экстракции можно применять для очистки продукта ацетилирова­ ния с целью получить постоянное значение удельной радиоактив­ ности; при этом не должно быть потерь меченых и немеченых ком­ понентов первоначальной смеси. Механические потери допустимы, если они не изменяют относительного состава продукта ацетилиро­ вания. Необходимость выделения части полного продукта ацетили­ рования отличает данный метод определения полного содержания гидроксильных групп от метода определения числа ацетильных групп, в котором требуется очистка лишь одного производного. Со­ держание (Е) ацетильной группы в полном продукте количествен­ ного ацетилирования пробы дается формулой

где 5 П — удельная радиоактивность продукта ацетилирования (мкКи/г); ,SP —удельная радиоактивность ангидрида (мкКи/мэкв).

Полное содержание (С) гидроксильной группы определяют по

которая справедлива лишь в случае, когда различия в составе про­ бы и продукта ее ацетилирования обусловлены только введением ацетильной группы (ср. уравнение (2), разд. III, гл. 14). При вы­ полнении этого условия нет необходимости знать вес ацетилированной части пробы и не играют большой роли механические потери в процессе удаления избытка ангидрида. Данный метод особенно удобен при определении гидроксильных групп в полимерах с малым содержанием этих групп. Очистку продукта ацетилирования сле­ дует проводить очень осторожно, чтобы не улетучились низкомоле­ кулярные производные. Удельную радиоактивность ангидрида опре­ деляют либо непосредственно [116], либо путем превращения его в подходящее производное, такое, как N-ацетил-п-толуидин [119] или ацетанилид. При измерении радиоактивности предпочитают жидкостные сцинтилляционные счетчики, однако можно использо­ вать и газовые счетчики [116].

В работе [119] описан метод, в котором уксусный ангидрид, ме­ ченный изотопом 14С, применялся для ацетилирования гидроксиль­ ных групп окисленного полиэтилена. Ацетилированные полимеры использовались затем в качестве стандартов в ИК-спектрофото- метрическом анализе. Реакцию вели в смеси (200; 15 по объему)

ксилола и пиридина, выбранную с учетом характеристик раствори­ мости полиэтилена. Полное содержание гидроксильных групп в по­ лиэтилене можно вычислить по формуле (4).

и 5 мКи/мл соответственно, определяли (З-метокси-4-оксифенил)- оксиуксусную кислоту в сыворотке. При использовании реагента, меченного тритием .(3Н), калибровочный график был прямолиней­ ным в интервале количеств кислоты от 1 до 40 нг.

Преимущество уксусного ангидрида как радиореагента стано­ вится еще более очевидным, если учесть, что получающиеся пре­ параты высокой удельной радиоактивности сравнительно легко очистить перегонкой под вакуумом. Примеси, появляющиеся при разрушении молекул ангидрида под действием р-частиц, которые образуются в результате радиоактивного распада, состоят главным образом из нелетучих веществ. Для удаления таких примесей ре­ комендуется непосредственно перед использованием, а также через каждые 1—2 недели перегонять бензольный раствор ангидрида, ме­ ченного изотопом 3Н [122].

Б. ПРЕВРАЩЕНИЕ В ЭФИРЫ ЗАМЕЩЕННЫХ БЕНЗОЙНЫХ КИСЛОТ

Многие соединения с гидроксильными группами количественно этерифицируются при нагревании с обратным холодильником

схлорангидридами в пиридине, а другие — часто и в более мягких условиях. Избыток хлорангидрида можно удалить путем гидролиза

споследующей экстракцией разбавленной щелочью или путем

осаждения образовавшегося производного в воде после добавления этанола.

Для определения макроколичеств соединений с активными гид­ роксильными группами был предложен комбинированный метод [123], в котором используется меченый реагент — З-хлор-4-метокси- бензоил-36С1-хлорид в сочетании с прямым изотопным разбавле­ нием. Реагент синтезируют в два этапа: сначала обрабатывают n-метоксибензойную кислоту элементарным изотопом 36С, а затем полученный продукт с помощью тионилхлорида превращают в хлорангидрид. Первым шагом в анализе является приготовление чистого меченого эфира определяемого соединения. Для этого 1 мэкв соединения, содержащего гидроксильные группы, раство­ ряют в 3 мл пиридина и добавляют в раствор 0,8 г нерадиоактив­ ного З-хлор-4-метоксибензоилхлорида. При анализе метанола берут 3 мэкв соединения и 1,2 г реагента. После кипячения с обратным холодильником в течение 20 мин раствор охлаждают и добавляют к нему 3 мл этанола. Затем в раствор быстро добавляют извест­ ную аликвотную часть раствора меченого производного в диоксане и сразу же осаждают продукт в холодной воде. Для очистки полу­ ченного соединения его перекристаллизовывают до тех пор, пока

выделенного производного (мкКи/г). Этот подход особенно удобен при использовании жидкостных сцинтилляционных счетчиков, поз­ воляющих вести измерения в очень широком диапазоне удельных радиоактивностей. Величины Wi и W в формуле (6) выбирают так, чтобы выполнялось неравенство 0,1 < Wi/W < 0,2; оптималь­ ное значение для отношения WJW близко к 0,125 [125]. Если коли­ чество полученного производного недостаточно для очистки до по­ лучения постоянного значения удельной радиоактивности, то в зна­ чение W, вычисленное по формуле (5) или (6), вносят поправку с учетом химической чистоты, вычисленной по понижению темпе­ ратуры плавления. Как видно из данных, приведенных в табл. 1.20,

а Взято из журнала «Anal. Chera.», 27, 390 (1955).

точность этого метода при определении химически чистого метанола и технического этиленгликоля, подвергнутого перегонке, очень вы­ сока. В этом определении использовали торцевой счетчик Гейге­ ра—Мюллера, вычисления вели по формуле (5), а результаты кор­ ректировали по понижению температуры плавления.

В данном случае температура плавления диэфира этиленгли­ коля отличалась от температуры плавления чистого производного менее чем на 0,2 °С, однако очистка производного перекристалли­ зацией до такой степени чистоты в присутствии значительных ко­ личеств гомологов может оказаться затруднительной. Так, напри­ мер, при анализе метанола в анализируемом продукте присутство­