книги из ГПНТБ / Инструментальные методы анализа функциональных групп органических соединений

160 Глава 3

счетчика Гейгера—Мюллера и определением чистоты по изменению температуры плавления. Полученные в этой работе значения выхо­ дов в анализах уксусной и бензойной кислот в присутствии значи­ тельных количеств воды и без нее, а также в анализах уксусного ангидрида и стеариновой кислоты приведены в табл. 3.8.

Чистоту проб уксусной и бензойной кислот и уксусного ангид­ рида, использованных в этих анализах, определяли разными хими­ ческими методами. Эти значения были равны 100,0 ± 0,2%, Ю0,1 ±

± 0,2% и 100,0 ± 0,4% соответственно. Чистота стеариновой кис­ лоты была оценена как равная 99%. В методе I стеариновую кис­ лоту кипятили с обратным холодильником с п-хлорфенилфосфазо- n-хлоранилидом и п-хлоранилином в толуоле. В методе II, который применим для кислот, образующих нелетучие хлориды, стеариновую кислоту сначала количественно превращали в соответствующий хлорангидрид действием тионилхлорида. Затем, после удаления из­ бытка тионилхлорида, хлорангидрид стеариновой кислоты осторож­ но нагревали с раствором /г-хлоранилина в ацетоне. Производное, которое получали в методе II, было труднее очищать, чем произ­ водное, полученное в методе I.

Важным преимуществом этого метода является возможность его использования для определения стеариновой кислоты в —^5:1 смеси стеариновой и пальмитиновой кислот. Его применяют тогда, когда в пробе имеется достаточно кислоты для образования произ­ водного в количестве, позволяющем очищать его путем перекри­ сталлизации. Для определения дикарбоновых кислот этот метод не­ применим из-за возможного образования моноанилидов или имидов. Степень превращения янтарной кислоты по результатам ме­ тода I составляла примерно 60%. а-Аминокислоты этим методом определить нельзя.

В работе [114] предлагалось использовать для определений ре­ акцию фосфазо-14С-соединения с монокарбоновыми кислотами, ко­ торые не содержат аминогрупп.

Представляет ценность и метод изотопного разбавления, в кото­ ром определяемая карбоновая кислота является радиореагентом, а производное образуется из нерадиоактивного соединения. В этом методе не требуется количественного получения производного. Он особенно удобен и при разделении кислот-гомологов или кислот, родственных по другим признакам, когда применение изотопного разбавления с использованием только меченой кислоты недоста­ точно эффективно. Этот метод применялся в работе [115] для ана­ лиза смесей хлорированных феноксиуксусных кислот. В этом ана­ лизе синтезировали меченые (изотопом 36С1) и чистые немеченые анализируемые кислоты (например, 2,4-дихлор- и 2,4,5-трихлор- феноксиуксусные). Известное количество меченой кислоты в рас­ творе добавляли к анализируемой пробе, а также к определенному количеству той же самой чистой немеченой кислоты. В раствор с меченой кислотой намеренно добавляли значительные количества

нерадиоактивных веществ, меченые аналоги которых с большой вероятностью могли присутствовать в растворе в виде примесей. Полученные таким образом образцы растворяли в водном растворе едкого натра, осаждали соляной кислотой и высушивали. Произ­ водные, полученные путем кипячения с обратным холодильником выделенных кислот с анилином, очищали перекристаллизацией. Радиоактивность измеряли методом, в котором не требуется знать удельную радиоактивность кислоты. Можно пользоваться и фор­ мулой (6 ) гл. 1, разд. V, выразив соответствующие величины в тре­ буемых единицах. Химическую чистоту анализируемых анилидов определяли по изменению температуры плавления, поскольку было трудно получать сверхчистые производные анализируемых кислот.

Вэтом методе не требуется высокой химической и радиохими­ ческой чистоты меченых кислот, поскольку вместе с радиоактив­ ной кислотой в раствор пробы намеренно добавляли значительные количества нерйдиоактивных примесей. При очистке радиоактивные примеси удалялись вместе со своими нерадиоактивными ана­ логами.

Вработе [116] было показано, что для количественного анализа смесей я-иоданилидов-13Ч можно использовать метод с автомати­ ческим измерением распределения радиоактивности вдоль колонки для жидкостной хроматографии, на которой осуществляют разде­

ление этих производных. Соответствующее устройство включает в себя сцинтилляционный детектор уизлучения, соединенный с из­ мерителем скорости поступления импульсов (ср. гл. 1, разд. V). Такой метод применялся лишь в определении смеси «-иоданилидов уксусной и пропионовой кислот, однако, в принципе, он применим для определения любого n-иоданилида или смеси л-иоданилидов, которые можно разделить или выделить методом колоночной хро­ матографии. Для полного использования возможностей этого ме­ тода необходимо количественно получать га-иоданилиды карбоно­ вых кислот.

Г. ПРЕВРАЩЕНИЕ В ПРОИЗВОДНЫЕ, МЕЧЕННЫЕ РАДИОАКТИВНЫМИ ИЗОТОПАМИ МЕТАЛЛОВ

Для определения микроколичеств соединений можно применять метод с образованием солей жирных кислот, меченных изотопами 6°Co, nomAg и после разделения этих кислот методом бумаж­ ной хроматографии с обращенными фазами. Полное содержание жирных кислот в анализируемой пробе можно довольно быстро определить с использованием либо 1I0mAgNO3, либо 203Hg(OAc)2, однако в методах с применением 60Со(ОАс)2 и получением хро­ матограмм требуются по крайней мере два реагента. Калибровоч­ ные данные получают путем анализа известных количеств чистых анализируемых кислот.

Ацетат кобальта-60, предложенный сначала в качестве реагента для определения олеиновой кислоты [117, 118] путем непосредствен­ ного нанесения кислоты на хроматографическую бумагу, исполь­ зовали затем для определения насыщенных высших жирных кислот, разделенных на бумаге, пропитанной гидрофобной жидкостью [119]. В водном растворе реагента соответствующая реакция проте­ кает медленно, поэтому для образования аммониевых солей пятна хроматограммы предварительно кондиционируют в газообразном аммиаке в закрытом сосуде в течение интервала времени продол­ жительностью до 8 ч. При определении олеиновой кислоты [117] пятна аммониевой соли обрабатывали несколькими каплями 2,5%-ного раствора в0Со(ОАс)2, имеющего удельную радиоактив­ ность 10 мкКи/мл; избыток реагента смывали водой, а радиоактив­ ность пятен измеряли торцевым счетчиком Гейгера—Мюллера. Этот метод применим, по-видимому, и для оценки полного содержа­ ния высших жирных кислот.

Лауриновую, миристиновую, пальмитиновую и стеариновую кислоты, каждая в количестве 40 мкг, разделяли методом хромато­ графии на бумаге с обращенными фазами. Для разделения исполь­ зовали бумагу, пропитанную смесью низкомолекулярных углевододов; точность определения от —1,3 до +1,4% [119]. В этом методе ориентационную, калибровочную и основную хроматограммы про­ являли и высушивали одновременно. После кондиционирования ам­ миаком в течение 6 — 8 ч ориентационную (калибровочную) хрома­ тограмму погружали в 0,03%-ный водный раствор нерадиоактив­ ного Со(ОАс) 2 и проявляли хорошо разделенные пятна 1 %-ным раствором сульфида аммония. Остальные хроматограммы после кондиционирования аммиаком разрезали на кусочки размером Зсм. Те кусочки, которые содержали часть идентифицированных одиноч­ ных пятен, погружали в раствор меченого реагента и промывали, в результате чего образовывался 60CoS. После этого определяли полную радиоактивность 60CoS, полученного из каждой кислоты. Содержание каждой кислоты в пробе вычисляли по полной радио­ активности соответствующих пятен основной и калибровочной хро­ матограмм, принимая во внимание, что полная радиоактивность пропорциональна количеству данной кислоты в пробе. Во избежа­ ние ошибок необходимо строго контролировать величину pH рас­ твора. При pH < 5,8 образование соли не является полным, а при pH > 6,0 на бумаге адсорбируются трудно десорбируемые ионы кобальта.

Если методы с использованием 60Со(ОАс)2 применяют для ана­ лиза проб, содержащих жирные кислоты с менее 1 2 атомами угле­ рода, то прежде всего путем анализа чистых кислот необходимо убедиться в том, что соли не теряются в процессе промывки.

Недавним достижением в развитии метода с использованием изотопа в0Со для определения полного содержания в пробе высших

6*

164 Глава 3

свободных насыщенных жирных кислот является измерение ра­ диоактивности солей, образуемых в смеси хлороформа и гептана [120]. На практике 50 нл гептана с содержанием 1—40 нМ анали­ зируемой кислоты смешивают в небольшой пробирке со 1 0 0 нл смеси 4: 1 (по объему) хлороформа и гептана. Затем в эту про-

.бирку добавляют 1 0 нл свежеприготовленного раствора, состав­ ленного из основного раствора 60Co(NO3)2, насыщенного водного раствора K2SO4 и триэтаноламина (10:9:1, по объему). В добав­ ляемой порции содержится 100 нМ нитрата кобальта. Для приго­ товления основного раствора в мерную колбу емкостью 1 0 0 мл переносят 60Co(NO3) 2 в таком количестве, чтобы его радиоактив­ ность была равна 2 0 мКи, нерадиоактивный нитрат кобальта в та­ ком количестве, чтобы получить 2 мМ соли, и 0,8 мл ледяной уксус­ ной кислоты. Объем содержимого колбы доводят до метки насы­ щенным водным раствором сульфата натрия. Пробирку закрывают пробкой и в течение 30 с энергично перемешивают ее содержимое. Раствор в пробирке центрифугируют, отбирают из нее 100 нл верх­ ней фазы и измеряют радиоактивность этой порции. Для получения более точных результатов следует пользоваться калибровочным

(метод измерения радиоактивности в работе не указан). В резуль­ тате проведения независимых опытов с использованием пальмити­ новой-1"^ кислоты и 60Co(NO3) 2 в ы я с н и л о с ь , что молярное отноше­ ние кислоты к кобальту в верхней фазе (органический раствори­ тель) составляло 2,03 ±0,16, хотя в этой фазе присутствовало лишь 94% радиоактивности, обусловленной пальмитиновой кислотой. Вы­ ходы для кислот, содержащих менее 1 2 углеродных атомов в моле­ куле, сильно зависели от молекулярного веса этих кислот; для каприловой и каприновой кислот они были равны 70 и 90% соот­ ветственно. Ненасыщенные жирные кислоты не анализировались.

В описанном в работах [121, 122] методе с использованием изо­ топа 1311 нерадиоактивные серебряные соли высших насыщенных жирных кислот являлись промежуточными продуктами. В анализе этим методом хроматограммы анализируемых кислот, полученные методом хроматографии с обращенными фазами, на 15 мин погру­ жали в насыщенный (примерно 0,05 М) раствор ацетата серебра и затем тщательно промывали водой. После этого в течение 15 мин их обрабатывали 0,01 М раствором К1311 с удельной радиоактивно­ стью 3—4 мкКи/мл, в результате чего образовывалось Ag131I. Для удаления избытка реагента хроматограммы еще раз промывали водой и высушивали в темноте. Радиоактивность пятен измеряли счетчиком с щелевой диафрагмой шириной 2 мм. Этот метод по­ зволил определить лауриновую, миристиновую, пальмитиновую и стеариновую кислоты в количествах 50—400 мкг с точностью 4,6—

с применением радиоактивных изотопов металлов. В этих методах измеряют радиоактивность либо производного целлюлозы, либо верхнего слоя жидкости; для получения точных результатов обыч­ но необходимо строго контролировать значение pH растворов в процессе реакции и промывки. Реагенты, которые использовались в анализах различных веществ, приведены в табл. 3.9,.

В работе [132, 133] на примере анализа щавелевой кислоты, оксалата аммония, лимонной кислоты, цитрата натрия и п-амино- салицилата натрия была показана возможность радиометрического титрования органических кислот и их растворимых солей соедине­ нием 110mAgNO3. Анализ этим методом включает в себя количествен­ ное осаждение солей серебра и последующее обнаружение избытка иона серебра в жидкой фазе после образования и осаждения твер­ дой фазы. Недавним усовершенствованием радиометрического ме­ тода определения щавелевой кислоты явилось титрование 0 ,1 н. или 0,01 н. раствором хлорида радиоактивного изотопа 45Са [137], кото­ рое осуществляют в приборе, сконструированном для обнаружения слабого p-излучения с помощью сцинтиллятора [138]. В работе [139] описано определение аскорбиновой кислоты методом окислительно­ восстановительного титрования, в котором титрование ведут хлори­ дом железа(Ш ), а в качестве индикатора используют амальгаму изотопа 66Zn.

Д. ДРУГИЕ МЕТОДЫ

Существуют и различные другие методы количествецного и ка­ чественного определения карбоксилсодержащих веществ, которые нашли широкое применение в биохимических анализах. Ценными реагентами являются тиоцианат-355 аммония [140—142] и фе- нил-3Н-изотиоцианат [143], которые применимы для количественного

28 Morris L. A, Holman R. T., Fontell K-, J. Am. Oil Chemists' Soc., 37, 323 (1960); J. Lipid Res., 1, 412 (1960).

29.Verhaar L. A. T„ de Wilt H. G. A, J. Chromatog., 41, 168 (1969).

30.Horning M. G., Boucher E. A., Moss A. M., Horning E. C., Anal. Letters, 1, 713 (1968).

31.Hoffman N. E., Killinger T. A., Anal. Chem., 41, 162 (1969).

32. Blau K., in «Biomedical Applications of Gas Chromatography», Vol. 2,

H. A. Szymanski, ed., Plenum, New York, 1968, p. 1—52.

33.Gehrke C. W., Stalling D. L., Separation Sci.. 2, 101 (1967).

33a.Zumwalt R. W., Roach D., Gehrke C. W., J. Chromatog., 53, 171 (1970).

34.Klebe J. F., Finkbeiner H., White D. M., J. Am. Chem. Soc., 88, 3390 (1966).

35.Pollock G. E„ Anal. Chem., 39, 1194 (1967).

36.Shenstone F. S., Vickery J. R., Johnson A. R., J. Agr. Food Chem., 13, 410

(1965).

37. Schneider E. L., Loke S. P., Hopkins D. T., J. Am. Oil Chemists' Soc., 45,

585 (1968).

38. Recourt J. H., Jurriens G., Schmitz M., J. Chromatog., 30, 35 (1967).

39.Krchma I. J., Gas Chromatog., 6, 457 (1968).

40.Monk P. R., Forrest W. W., J. Chromatog., 30, 203 (1967).

41.Huebner V. R., J. Am. Oil .Chemists' Soc., 36, 262 (1959).

42.Kuksis A., Breckenridge W. C., Marai A., Stachnyk 0., J. Am. Oil Chemists' Soc., 45, 537 (1968).

43.Watts R., Oils R., J. Lipid Res., 10, 33 (1969).

44.Hradec J., J. Chromatog., 32, 511 (1968).

45. Hadorn H., Zuercher K., Mitt. Gebiete Lebensm. Hyg., 59, 369 (1968).

46.Bezard A, Bugaut M., J. Chromatog. Sci., 7, 639 (1969).

47.Kates M., J. Lipid Res., 5, 132 (1964).

48.Kleiman R., Earle F. R., Wolff J. A., J. Am. Oil Chemists' Soc., 46, 505 (1969).

50.Peterson J. A, de Schmertzing H., Abel K., J. Gas Chromatog., 3, 126 (1965).

51.Mason M. E., Waller G. R., Anal. Chem., 36, 583 (1964).

52.Jamieson G. R., Reid E. H., J. Chromatog., 17, 230 (1965).

53.Christopherson S. W., Glass R. A., J. Dairy Sci., 52, 1289 (1969).

54.Oette K., Doss M., J. Chromatog., 32, 439 (1968).

55.Davison V. A., Dutton H. J., J. Lipid Res., 8, 147 (1967).

56.Ailing C., Svennerholm A., Tichy A, J. Chromatog., 34, 413 (1968).

57.Luddy F. E., Barford R. A., Herb S. F., Magiaman P., J. Am. Oil Chemists' Soc., 45, 549 (1968).

58.Horrocks A. A., Cornwell D. G., J. Lipid Res., 3, 165 (1962).

59.Archibald F. M., Skipski V. P., J. Lipid Res., 7, 442 (1966).

60.Barron E. A, Mooney A. A., Anal. Chem., 40, 1742 (1968).

61.Acree F., Jr., Beroza M., J. Econom. Entomol., 55, 619 (1962).

63.Трубникова В. И., Малахова Л. М., Жданович Е. С., Журн. анал. хим., 23, 1546 (1968).

64.Radhakrishnamurthy В., Dalferes Е. Т., Jr., Berenson G. S., Anal. Biochem., 26,61 (1968).

65.Hoodless R. A., Weston R. E., Analyst, 94, 670 (1969).

66.Чумаченко M. H., Твердюкова Л. Б., Леенсон Ф. Г., Журн. анал. хим., 21, 617 (1966).

67.Sennello А. Т., Argoudelis С. A, Anal. Chem., 41, 171 (1969).

68.Mori S., Furusawa M., Takeuchi T„ Anal. Chem., 42, 661 (1970).

69.Briggs G. G., Dawson J. E., J. Agr. Food Chem., 18, 97 (1970).

70.Kiessting W., Moll К. K., J. Prakt. Chem., 311, 876 (1969).

71.Taramasso M., Guerra A., J. Gas Chromatog., 3, 138 (1965).

72.Oda M., Suzuki K., Kashiwa T., Ikeda J\., Hattori T., Bunseki Kagaku, 18, 1267 (1969).

74.Szebelledy S. L., Somogyi S. F., Z. Anal. Chem., 112, 400 (1938).

75.Lingane J. J., Small L. A., Anal. Chem., 21, 1119 (1949).

76.Carson W. N., Jr., Ко R., Anal. Chem., 23, 1019 (1951).

77.Crisler R. O., Coulson R. D., J. Am. Oil Chemists' Soc., 39, 470 (1962).

78. Streuli C. A., Cincotta J'. ' J., Maricle D. L., Mead К. K., Anal. Chem., 36, 1371 (1964).

79.Johansson G., Talanta, 11, 789 (1964).

80.Gaslini F., Nahum L. Z., Anal. Chem., 31, 989 (1959).

МЕТОДЫ ЯДЕРНОГО МАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА

81. Purcell J. M., Morris S. G., Susi H., Anal. Chem., 38, 588 (1966).

82.Sawyer D. T., Brannan J. R., Anal. Chem., 38, 192 (1966).

83.Paulsen P. J., Cooke W. D„ Anal. Chem., 36, 1713 (1964).

84.Jungnickel J. L., Forbes J. W., Anal. Chem., 35, 938 (1963).

85.Parker J. R., Anal. Chem., 41, 1103 (1969).

86.Rosado-Lojo O., Hancock С. K., Danti A., J. Org. Chem., 31, 1899 (1966).

87.Kan R. O., J. Am. Chem. Soc., 86, 5180 (1964).

88.Percival D. F., Stevens M. P., Anal. Chem., 36, 1574 (1964).

89.Konishi K., Kanoh Y., Anal. Chem., 40, 1881 (1968).

90.Brame E. G., Jr., Ferguson R., Thomas G. J., Jr., Anal. Chem., 39, 517 (1907).

J.Agr. Food Chem., 7, 422 (1959).

101. Lazer L. S., Baumgartner W. E., Dahlstrom R. V., J. Agr. Food Chem., fl,

24 (1961).

102.Baumgartner W. E., in «Advances in Tracer Methodology», Vol. 1, S. Roth child, ed.. Plenum, New York, 1962, pp. 257—262.

103.Papirer E., Donnet J.-B., Bull. Soc. Chim. France, 1966, 2033.

104.Melander L., Arkiv Kemi, 3, 525 (1951).

105. Verly W. G„ Rachele J. R„ du Vigneaud V., Eidinof M. L„ Knoll J. E.

J. Am. Chem. Soc., 74, 594 (1952).

106.Koch G. K., Jurriens G., Nature, 208, 1312 (1965).

107.Fischer G. A., Kabara J. J., Anal. Biochem., 25, 432 (1968).

108.Garmon R. G., Gibson M. E., Anal. Biochem., 37, 1309 (1965).

109.Metcalfe L. D., Schmitz A. A., Anal. Chem., 33, 363 (1961).

110. Eberhagen D., Wittman B., Seitz W., Z. Anal. Chem., 237, 17 (1968).

111.Kibrick A. C., Skupp S. J., Anal. Chem., 31, 2057 (1959).

112.Steim J. M., Benson A. A., Anal. Biochem., 9, 21 (1964). ЦЗ. Sorenson P., Ада1. Ch£m., 28, 1318 (1956).