книги из ГПНТБ / Инструментальные методы анализа функциональных групп органических соединений

тилдисилоксан. В качестве растворителя можно брать и трифторуксусную кислоту. Для приготовления уретанов применялись политетраметиленгликоль и полипропиленгликоль. Эти простые по­ лиэфиры подвергали действию метилен-бис- (4-фенилизоцианата) и толуолдиизоцианата. Из сложных полиэфиров использовали полидиэтиленгликольадипинат,политетраметиленгликольадипинат, полиэтиленгликольадипинат, поли(этиленгликоль + 1,2-пропиленгли- коль)-адипинат; эти полиэфиры превращали в уретаны путем реак­ ции с метилен-бис-(4-фенилизоцианатом) и толуолдиизоцианатом.

Несмотря на то что определение линии резонанса, обусловлен­ ной группой NH, может вызывать некоторые затруднения при ин­ тегрировании спектра, анализ полиуретанов методом ЯМР по­ зволяет получать хорошие количественные данные. Можно оценить и молекулярный вес простого полиэфира или сложного полиэфиргликоля. Приведенная ниже таблица показывает, что результаты оценки методом ЯМР мольных долей компонентов полиуретана, полученного из полиэфира, хорошо согласуются с аналогичными результатами, полученными с использованием гидролиза.

В работе [90] приведены также и значения химических сдвигов для этих соединений.

Д. АМИДЫ И ПРОИЗВОДНЫЕ МОЧЕВИНЫ

Метод Лидера (гл. 1, разд. IV, А) применяли также в анализе амидов и производных мочевины. Было обнаружено, что значения химических сдвигов для линий резонанса на ядрах 19F амидов, монозамещенных производных мочевины и сульфамидов нахо­ дятся в пределах 0—1,8 млн-1 относительно линии для аддукта гексафторацетона и воды. Опубликованы также данные для таких соединений, как ацетамид, акриламид, хлорацетамид, бензамид, сульфаниламид, n-толуолсульфамид, гидразин, 2,4-динитрофенил- гидразин, метилтиомочевина, фенилмочевина и метилмочевина. По наличию линий резонанса в более высоком поле можно вы­ явить помехи от других компонентов с активными атомами водо­ рода, которые могут затруднять анализ.

Ма и Ворнхофф (ср. гл. 11, разд. IV, А) получили следующие

данные:

Значения химического сдвига для группы

N—СН3

V.РАДИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Д. Кэмпбелл

Важное значение высших жирных кислот в биохимии и химии природных соединений обусловило создание нескольких чувстви­ тельных радиохимических методов анализа микро- и полумикроколичеств этих соединений. В этих методах наиболее широко при­ меняются такие производные этих кислот, как их метиловые-14С и метиловые-3Н эфиры, а также мыла, меченные радиоактивными изотопами металлов. Макроколичества многих монокарбоновых кислот можно определить методом изотопного разбавления в форме анилидов или замещенных анилидов. Карбоксильные груп­ пы, содержащиеся в некоторых целлюлозных материалах, можно определить в форме солей радиоактивных металлов.

А. ПРЕВРАЩЕНИЕ В МЕТИЛОВЫЕ ЭФИРЫ

Определение отдельных карбоновых кислот в смесях методом хроматографического разделения существенно облегчается, если сначала превратить эти кислоты в их метиловые эфиры. Этот же подход применим и для определения суммы трех кислот. Произ­ водные для радиохимического анализа количественно получают путем обработки кислот а) диазометаном-14С в смеси эфир — мета­ нол, б) водой, насыщенной тритием, в эфире и затем нерадиоак­ тивным диазометаном, в) раствором едкого натра и метилата нат­ рия, меченного изотопом 3Н, в метаноле-3Н и г) метанолом-14С в присутствии трехфтористого бора. В каждом из этих методов из­ быток реагента удалить легко, и потому все они имеют высокую чувствительность.

Диазометан быстро и количественно реагирует с карбоновыми {щсдотами в смеси этилового эфира и метанола (9:1) при ксщ-

натной температуре без сколько-нибудь существенных побочных реакций:

R-COOH + i«CHaN2 — ►R—С 0 0 14СН3 + N2

На практике радиореагент получают по мере необходимости в ат­ мосфере азота в замкнутой системе, содержащей пробу анализи­ руемой кислоты; устойчивая желтая окраска раствора указывает на присутствие в нем избытка реагента. Удаляют этот избыток, пропуская через раствор поток азота. Диазометан-14С получают путем нагревания меченого нитрозопроизводного, приготовленного из метиламина-14С, в присутствии сильного основания. На прак­ тике для синтеза немеченого диазометана широко используют большое число различных Соединений, однако для получения ме­ ченого диазометана применяют лишь N-метил-М-нитрозо-п-толуол- сульфамид [91, 94, 95], Ы-метил-И-нитрозомочевину [92] и N-нит- розо-Ы-метиламиноизобутилкетон [93]. Лучше всего применять для этой цели нитрозосульфамид (НСА), поскольку это соединение, относительно устойчивое при комнатной температуре, позволяет получать 14CH2N2 с выходом до 85% и имеется в продаже.

При исследовании условий этерификации выяснилось, что об­ разование эфира, например пальмитиновой кислоты, в смеси 9: 1 (по объему) этилового эфира и метанола полностью завершается за 10 мин [91]. При этом метанол, очевидно, действует как катали­ затор, поскольку значение молярной удельной радиоактивности получаемого эфира хорошо согласуется с молярной радиоактив­ ностью меченого НСА. Это наглядно свидетельствует в пользу применения 14CH2N2 в качестве радиореагента для количествен­ ного анализа в присутствии метанола. В эфире или метаноле, взя­ тых в отдельности, реакции не завершались и за 30 мин. Увеличе­ ние продолжительности реакции нежелательно, поскольку оно ве­ дет к образованию примесей, например полимера (14СН2)*, что приводит к помутнению раствора или появлению в нем хлопьев.

Получение диазометана-14С и этерификацию можно осущест­ вить в довольно простом приборе, состоящем из набора пробирок с боковыми трубками [91]. В первой из этих пробирок происходит насыщение азота (газа-носителя) эфиром. Во второй образуется 14CH2N2 путем обработки НСА-,4С (примерно 2 мМ на 1 мМ одноосновной кислоты), растворенного в смеси эфира и моноэтилового эфира диэтиленгликоля, водным раствором КОН. В треть­ ей пробирке содержится 5—30 мг кислот в смеси 9 : 1 эфира и ме­ танола. Образование производных и выделение непрореагировав­ шего реагента занимает 10—12 мин. В работах [92, 93] описан другой прибор, в котором используются колбы емкостью 5 мл, краны и набор поглотителей для сбора избытка реагента; с его помощью анализируют пробы величиной 3—6 мг, реакцию ведут в течение 1—4 ч при комнатной температуре. О завершении эте­ рификации под действием CH2N2 судят по появлению желтого от-, тенка раствора.

[104, 105]. Привлекательность основанного на ней метода заклю­ чается в том, что вода, насыщенная тритием, недорога и ее легко получить. Применимость этого метода к анализу смесей кислот основана на том, что тритий вводится в кислоты и эфиры без ка­ ких-либо ограничений.

Для количественного анализа, основанного на этом методе [106], 0,2 мл раствора 3НгО в безводном диэтиловом эфире (1 нл воды на 1 мл эфира, полная радиоактивность 6,67 мкКи) добав­ ляют к не более чем 0,033 мэкв смеси кислот в безводном диэти­ ловом эфире, ацетоне или дйоксане. Спустя 15 мин кислоты коли­ чественно этерифицируют, добавляя к смеси раствор диазометана в эфире. Продукты этерификации разделяют методом тонкослой­ ной хроматографии (ТСХ) на силикагеле, проявляют пятна раз­ деленных эфиров, опрыскивая их подходящим реагентом, и изме­ ряют их радиоактивность жидкостным сцинтилляционным счетчи­ ком. При этом эфиры можно либо экстрагировать из силикагеля смесью диэтилового эфира и гексана (7 : 3 по объему) с последую­ щим выпариванием растворителей и добавлением раствора сцин­ тиллятора, либо путем измерения радиоактивности взвесей, полу­ ченных путем соскабливания соответствующих пятен с пластинки для ТСХ. Второй метод часто предпочитают при анализе высоко­ полярных кислот. При использовании первого метода экстракция из адсорбента должна быть количественной. Если в пробе содер­ жится менее 1—5 мг жирных кислот, то перед хроматографирова­ нием в раствор необходимо добавить нерадиоактивные метиловые эфиры анализируемых соединений. При этом метод становится применимым для анализа микрограммовых количеств соединений. Для калибровки метода к пробе добавляют определенные коли­ чества анализируемых кислот и повторяют весь анализ. Анализ известных смесей стеариновой, бензойной и фталевой кислот, а также смесей стеариновой и dl-винной кислот показал, что введе­

и бензойной кислот, меченных изотопом 14С. Данный метод дает результаты с воспроизводимостью ±5% .

Воду, насыщенную тритием, в комбинации с нерадиоактив­ ным диазометаном использовали и для определения отношения количеств гиббереллиновой кислоты и ее дигидропроизводного в спиртных напитках [102]. В работе [102] высказывалось предполо­ жение о том, что для приготовления этиловых и пропиловых-3Н эфиров с целью количественного анализа карбоновых кислот мож­ но использовать диазоэтан и диазопропан, меченные тритием, од­ нако работ по практическому применению такого метода нет.

Заслуживающим внимания реагентом для приготовления эфи­ ров является метанол, меченный изотопами 14С или 3Н. Он

156 Глава 3

относительно недорог, обусловленную им радиоактивность легко измерять с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика и, кроме того, его уже давно применяют в обычных (нерадиохими­ ческих) анализах. В работе [107] описан применимый для непосред­ ственного определения как свободных, так и связанных жирных кислот метод этерификации и переэтерификации, в котором ана­ лиз ведут путем обработки раствора пробы в хлороформе раство­ ром едкого натра и метилата натрия-3Н в метаноле-3Н, взятом в объеме, равном объему анализируемого раствора пробы. Реагент приготавливают, растворяя чистый металлический натрий (до по­ лучения концентрации 4 мг/мл) в 0,5 н. растворе едкого натра в метаноле-3Н. Для того чтобы замедлить разложение полученного раствора, его хранят в полиэтиленовом сосуде на холоду; кроме того, необходимо предохранять этот раствор от контакта с возду­ хом, поскольку под действием воздуха в течение 4 ч в реагенте образовывалось большое количество производных. Для проведения анализа сухую пробу растворяют в 0,1—1 мл хлороформа и добав­ ляют в полученный раствор такой же объем реагента. Затем сосуд с раствором плотно закрывают пробкой и встряхивают в течение 1 ч при комнатной температуре. Сразу же по окончании встряхивания к раствору в сосуде добавляют 1 каплю раствора фенолфталеина в абсолютном метаноле и нейтрализуют его ледяной уксусной кис­ лотой. После этого полученный раствор количественно (смывая хлороформом) переносят в делительную воронку и дважды промы­ вают десятикратным избытком (по объему) дистиллированной воды; для определения менее 1 мкМ кислоты рекомендуется про­ вести еще одно дополнительное промывание. Хлороформную фазу переносят из воронки в другой сосуд и испаряют растворитель под вакуумом. К полученному остатку добавляют метанол, затем вра­ щают сосуд и выжидают испарения метанола; при определении менее 1мкМ кислоты эту процедуру повторяют несколько раз. Для измерения радиоактивности полученного остатка его растворяют

втолуольном растворе сцинтиллятора. Для того чтобы убедиться

вотсутствии нелетучих радиоактивных примесей в метаноле, про­ водят холостой опыт. Результаты, полученные путем непосред­ ственного измерения радиоактивности метанола, хорошо согласо­

вывались с результатами, полученными с использованием стандарт­ ных проб кислоты. Если в пробе содержатся глицериды или другие эфиры, то перед определением свободной кислоты их сле­ дует удалять из раствора. Быстрота анализа, простота и хорошая точность результатов при определении наномольных концентраций делают этот метод весьма привлекательным для определения пол­ ного содержания жирных кислот. К положительным его чертам относятся также и используемые в нем мягкие условия этерифика­ ции и количественная переэтерификация, катализируемая едким натром.

Реакция этерификации под действием метанола-14С, катализи­

руемая трехфтористым бором, оказалась полезной в определении концевых карбоксильных групп в полимерах типа найлона [108]. Реагент для этой реакции приготавливали, добавляя 7,5 г трехфто­ ристого бора к примерно 39,5 мл метанола. Около 30 мг анализи­ руемого полимера растворяли в 0,3 мл реагента при температуре 60 °С и выдерживали полученный раствор при этой температуре в течение 10 мин. После осаждения полимера в воде измеряли его радиоактивность методом сжигания в кислороде, используя затем жидкостной сцинтилляционный счетчик. Реагент СН3ОН • BF3 обес­ печивает количественную этерификацию жирных кислот при темпе­ ратуре кипения в течение 2 мин [109].

В работе [ПО] описан анализ смесей жирных кислот от С12 до С20, в котором сначала проводили газохроматографическое разде­ ление метиловых-14С эфиров этих кислот, а затем определяли их радиоактивность в газовой фазе.

При выделении метиловых эфиров следует следить за тем, чтобы не было потерь низкомолекулярных производных за счет их улетучивания.

Б. ПРЕВРАЩЕНИЕ В я-БРОМФЕНАЦИЛЭФИРЫ

Хотя реакция «-бромфенацилбромида с солями щелочных ме­ таллов карбоновых кислот не всегда протекает количественно, она позволяет получать производные, широко применяемые для иден­ тификации:

NaBr

Для определения миристиновой кислоты был создан метод с ис­ пользованием радиореагента и обратного изотопного разбавления [111], в котором применяется п-бромфенацил-иС-бромид. Этот ме­ тод применим также и для анализа других жирных кислот. Степень этерификации миристиновой кислоты в 95%-ном этаноле (pH раст­ вора выше 8,5) при температуре кипения достигает максимального значения (60%) за 50 мин и остается постоянной по крайней мере в течение 30 мин. Предварительно этот максимум определили пу­ тем анализа на бром. Сам метод основан на обработке анализи­ руемой смеси меченым реагентом в условиях, аналогичных тем,

которые описаны выше, с последующим добавлением гораздо боль­ шего известного количества нерадиоактивного эфира. После очистки полученного эфира миристиновой кислоты до получения постоян­ ного значения удельной радиоактивности количество эфира в пробе вычисляют по формуле (2) гл. И, разд. V и после умножения по­ лученного результата примерно на 0,6 получают количество кислоты в пробе. Среднее значение коэффициента (равное 0,6) установили, действуя реагентом на пробы миристиновой кислоты известной ве­ личины. Для определения этим методом других жирных кислот необходимо проверить воспроизводимость соответствующих реак­ ций этерификации.

В работе [122] предлагается метод определения микро- и полумикроколичеств л-бромфенацилэфиров карбоновых кислот, в кото­ ром производные сначала разделяют методом хроматографии на бумаге, затем активируют пучком нейтронов и определяют хрома­ тографическим методом. При этом необходимо количественное или воспроизводимое образование эфиров. Для калибровки метода тре­ буется параллельно с основным анализом вести активационный анализ известных проб бромсодержащего соединения. Наивысшая чувствительность метода достигается при использовании мощного потока нейтронов (ядерныйреактор).

В. ПРЕВРАЩЕНИЕ В НЕЗАМЕЩЕННЫЕ И ЗАМЕЩЕННЫЕ АНИЛИДЫ

Хорошим реагентом для определения макроколичеств карбоно­ вых кислот, ангидридов и хлорангидридов методом изотопного раз­ бавления является л-хлоранилин-36С1. Для оценки содержания этих соединений в форме анилидов применяли также и некоторые хлор- феноксиуксусные-36С1 кислоты. Как правило, анилиды имеют резко выраженную температуру плавления и их можно очищать путем кристаллизации. Многообещающим радиореагентом для анализа меньших количеств веществ является л-иоданилин-ш 1. Образуемые им меченые л-иоданилиды сначала вводят в хроматографическую колонку, а затем счетчиком с твердым сцинтиллятором измеряют распределение радиоактивности вдоль этой колонки. Преимущест­ во первичных ароматических аминов состоит в том, что обычно ангидриды и хлорангидриДы карбоновых кислот реагируют с ними количественно в мягких условиях.

В работе [131] описан метод, в котором л-хлоранилин-36С1 ис­ пользуется для прямого изотопного разбавления после превра­ щения анализируемой карбоновой кислоты, ангидрида или хлорангидрида в нерадиоактивный л-хлоранилид. Меченый л-хлоранилин получают путем хлорирования ацетанилида элементарным хлором (изотоп 36С1) и последующего гидролиза образующегося л-хлор- ацетанилида-збС1 концентрированной соляной кислотой. После этого приготавливают чистое меченое производное анализируемой кислоты. Кислоты, содержащиеся в анализируемой пробе, количест­

венно превращают в нерадиоактивные анилиды, обрабатывая их га-хлорфенилфосфазо-я-хлоранилидом

CI N Р — NH CI

в присутствии нерадиоактивного я-хлоранилина. Для проведения

0,01 мкКи. Затем в раствор добавляют 10 мл этанола и кипятят его до тех пор, пока он не станет почти прозрачным. Во время ки­ пячения вместе с водяным паром из раствора удаляются органиче­ ские растворители. После кипячения в раствор добавляют 10 мл 4 н. НС1 и отфильтровывают образовавшийся осадок. Неочищенный я-хлоранилид-36С1 очищают путем перекристаллизации из подходя­ щего растворителя до тех пор, пока его температура плавления не будет отличаться от температуры плавления чистого производного менее чем на I °С. Химическую чистоту очищенного производного определяют по его температуре плавления с использованием из­ вестной константы понижения температуры плавленця. Если получено достаточное количество я-хлоранилида-36С1, то его можно очищать до получения постоянного значения удельной радиоактив­ ности (или, точнее, до тех пор, пока не станут близкими значения удельной радиоактивности производного, выделенного из фильтра­ та, и перекристаллизованного производного). Для перекристаллиза­ ции желательно использовать два растворителя.

Рекомендуется также использовать и стандартный раствор. Его приготавливают, смешивая известное количество меченого анилида с определенным количеством чистого немеченого соединения, при­ мерно равном тому количеству анилида, которое получено из ана­ лизируемой пробы [113]; удельную радиоактивность этой смеси определяют тем же методом, что и в анализе пробы. В данном ме­ тоде не требуется измерять удельную радиоактивность добав­ ляемого меченого я-хлоранилида, и содержание кислоты в пробе вычисляют по формуле (5) гл. 1, разд V. Если же значение удель­ ной радиоактивности добавленного я-хлоранилида известно, то со­