книги из ГПНТБ / Инструментальные методы анализа функциональных групп органических соединений

В других методах метилирования применяется метанол и диметилсульфат или катализатор (BFs, НС1, H2S04). Лилиэдаль [9] сравнил между собой несколько методов метилирования, приме­ няемых в анализе пиридинкарбоновых кислот; ни один из этих методов не подходил одновременно для всех исследовавшихся кислот, однако хотя бы один из методов позволял получить для каждой из них количественные результаты.

Этерификация с использованием остатков более высокомоле­ кулярных спиртов в общем идет так же, как и метилирование. Для получения более высокой чувствительности можно использо­ вать производные, позволяющие применить электронно-захватный детектор (2 -хлорэтил, пентафторбензил, галогендиметилсилил).

Б. ВЫЧИТАНИЕ СВОБОДНЫХ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ

Иногда удобнее определять жирные кислоты непосредственно, не превращая их в производные. Таким образом были, например, количественно определены летучие жирные кислоты Q —Се в жидком содержимом рубца [10—12]. В прямом анализе в насадку хроматографической колонки добавляют фосфорную кислоту и (или) обрабатывают пробу кислотой для подавления процессов ионизации, димеризации или адсорбции кислот в процессе разде­ ления [13, 14]. Используя насадку из стеклянных шариков диамет­ ром 2 0 0 мкм, на поверхность которых нанесено 0,25% жидкой фазы карбовакс 20М и 0,4% изофталевой кислоты, определили жирные

кислоты С2—Cie [15].

Для вычитания свободных кислот на пути газового потока, проходящего через колонку, устанавливают реакционную петлю (описанную в гл. 1, разд. II, Е). Эта петля [16] имеет длину около 15 см и содержит смесь окиси цинка (1 0 % по весу) и насадки, ис­ пользуемой для хроматографического разделения свободных кис­ лот (25% фазы LAC-2R-446 и 2% фосфорной кислоты на целите 545 с размером частиц 60/80 меш [17]). В такой петле количест­ венно вычитались все карбоновые кислоты, за исключением тех, которые считаются пространственно затрудненными (а-алкилза- мещенные). Время удерживания хроматографических пиков пространствено затрудненных кислот увеличивалось, значительно уменьшались высоты пиков и сильно расширялись их фронты. (По этим признакам можно определять a -замещение в неизвест­ ных кислотах.) По хроматограммам, полученным с применением

•петли для вычитания и без нее, можно определять пики анализи­ руемых кислот, а по разности площадей хроматографических пи­ ков — количества кислот. Реакционная петля имеет ограниченный срок службы и ее нужно периодически проверять и заменять, если Произошло ее насыщение. Петля с ogpcpio цинка, используемая для количественного вычитания карбоновых кислот, не мешает

хроматографическому разделению альдегидов и соответствующих эфиров, образующихся в результате пиролиза озонированных ме­ тиловых эфиров жирных кислот [18].

В. ДЕКАРБОКСИЛИРОВАНИЕ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ

Замещенные малоновые кислоты можно декарбоксилировать во входном устройстве газового хроматографа и анализировать образующиеся при этом монокарбоновые кислоты методом ГХ [19]. В анализе, описанном в работе [19], температура входного устройства находилась в пределах 190—220 °С, причем максималь­ ную из этих температур использовали при определении дизамещенных малоновых кислот. В работе [20] описан чувствительный метод анализа гербицида пиклорам (4-амино-3,5,6-трихлорпико- линовая кислота), в котором применяется пиролитическое декарбоксилирование непосредственно перед хроматографической ко­ лонкой при температуре 385 °С с последующим разделением и определеним продуктов декарбоксилирования.

При обработке а-оксикислот йодной кислотой они расщеп­ ляются с образованием СОг и альдегида или кетона, которые можно определить с помощью ГХ (гл. 1, разд. II, Д). Для опре­ деления количества а-оксигруппы (а-оксикислоты) в молекуле можно измерять и количество выделяющегося СОг. Для этого подходит метод, описанный в разд. Г, который первоначально предназначали для определения ароматических и гетероцикличе­ ских карбоновых кислот.

Г. МИКРОДЕКАРБОКСИЛИРОВАНИЕ АРОМАТИЧЕСКИХ, ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИХ (АРОМАТИЧЕСКОГО ТИПА) И а-ОКСИКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ

Метод Ма, Шанга и Манша [21]

Пробу нагревают в закрытом сосуде в присутствии хинолина и карбоната меди, а затем образовавшийся С О г вводят в газовый хроматограф и измеряют высоту его хроматографического пика, которая линейно связана с количеством карбоновой кислоты в пробе. Образование С О г идет по уравнению

рость потока 90 мл/мин, температура колонки 51°С. К хромато­ графу подключают реакционный сосуд, показанный на рис. 3.1, причем трубку А сосуда подсоединяют к источнику гелия, а

трубку Б — к входному устройству хроматографа. Средняя часть В сосуда имеет длину 90 мм, внешний диаметр 20 мм и емкость 8 мл. К трубкам Л и Б (длина 50 мм и внешний диаметр 8 мм) присоеди­ няют соединительные трубки с поворотными кранами. Внутри со­ суда В имеется трубка, припаянная к трубке А (см. рис. 3.1). За­ крывают сосуд резиновой пробкой Г.

Для нагревания реакционной смеси в сосуде В используют

Выполнение анализа. Берут навеску образца, в которой содер-

литель и самописец. В результате должна получиться устойчивая нулевая линия; в противном случае продолжают продувать сосуд гелием. После этого оба крана закрывают и в течение 45 мин на­

100 °С, а затем открывают оба крана, и поток гелия переносит об­ разовавшийся С02 в хроматограф. Наконец, измеряют высоту

хроматографического пика С02, который выходит из колонки че­ рез 4—5 с после открытия кранов.

Результаты и их обсуждение. Для о-, м- и n-оксибензойных, о-ами-

цобензойной, о-хлорбензойной, 2,5-диоксибензойной, 2,4-дихлор- бензойной, 2,4- и 3,5-динитробензойных и 2-фуранкарбоновой кислот были получены линейные зависимости количества образую­ щегося С02 от содержания кислоты в пробе (0,05—0,15 мэкв). Ка­ либровочные графики -получали для каждой кислоты отдельно. (Они не проходят через начало координат, возможно, из-за того, что С02 частично образуется и из кислоты, и из карбоната меди.) Утверждается, что этот метод более специфичен и точен, чем манометрические методы (например, метод Губахера) [23].

Как сообщил Бероза [24], по существу одним и тем же методом легко декарбоксилируются гетероциклические карбоновые кис­ лоты ароматического типа (например, никотиновая, изоникотиновая, пиразин-2 ,3-дикарбоновая и хинолиновая), а также а-окси- кислоты, однако для полного завершения реакций с некоторыми из этих кислот может потребоваться до 2 ч. Описанный выше ме­ тод применим для этих соединений в том случае, если увеличить продолжительность нагревания реакционной смеси.

Точность и специфичность данного метода увеличивается при

Вместо описанного выше хроматографа можно использовать уста­ новку Нортона, Тернера и Салмона (гл. 8 , разд. II).

Д. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОКСИКИСЛОТ

Для того чтобы обеспечить получение хороших количественных данных при анализе оксикислот методом ГХ, эти кислоты обычно превращают в производные по полярным ОН- и СООН-группам. В обзоре Радина [26], посвященном выделению, определению структуры и количественному анализу жирных оксикислот, ГХ рассматривается как метод разделения смесей этих кислот с целью их количественного анализа. Жирные кислоты, не содержащие гидроксильных групп, первоначально разделяли экстракцией рас­ творителями, осаждением или хроматографическим методом. Не­ которые типичные методы химических превращений жирных окси­ кислот в хроматографическом анализе показаны в табл. 3.5. В ос­ новном эти методы совпадают с методами, используемыми для превращения в производные по каждой из этих групп в отдель­ ности (разд. II, А — II, Г гл. 1 для ОН-группы и разд. II, А настоя­ щей главы для СООН-группы). По различным причинам (стрем­ ление избежать помех, ускорить или облегчить анализ, добиться более полного прохождения реакции и т. п.) применение одних производных предпочитают другим.

Таблица 3.5

Характеристики некоторых типичных методов, используемых для количественных определений оксикислот методом ГХ

С о к р а щ е н и я : ТМС—триметилсилил; ГМДС—гексаметилдисилазан; ТМХС—триме-

тилхлорсилан; БСТФА—бис-(триметилсилил)трифторацетамид; БСА—бнс-(триметилсилил)- ацетамид.

185(1969).

4.Capella P., Galli C., Fumagalli R., Lipids, 3, 431 (1963).

5.Prevot A., Barbati C., Rev. Franc. Corps Gras, 15, 157 (1968).

6. Sprinkle T. J., Porter A. H., Greer M., Williams С. M., Clin. Chim. Acta, 25,

409(1969).

7.Horning M. G., Boucher E. A., Moss A. M., Horning E. C., Anal. Letters, 1,

713(1968).

8.Back P„ Z. Klin. Chem. Klin. Biochem., 7, 365 (1969).

9.Gellerman J. L., Schlenk H., Anal. Chem., 40, 739 (1968).

10. Glaze N. C., Wilcox AL, J. Chromatog., 34, 391 (1968).

Из некоторых опубликованных работ следует, что для опреде­ ления насыщенных жирных оксикислот с менее чем 2 0 атомами углерода в цепи нет необходимости превращать их в производные по ОН-группе [27]. Полагают [26], что в этих случаях достаточно использовать для анализа стеклянные, надежно силанизованные колонки и носители и невысокие концентрации жидкой фазы на но­ сителе. Однако количественные данные, полученные без образова­ ния производных по ОН-группе, по-видимому, менее надежны.

Некоторые жирные кислоты, в которых ОН-группа близка к двойной связи, разлагаются (дегидратируются) в газохроматогра­ фической колонке, причем даже и после ацетилирования [28].

Анализ а-оксикислот путем окисления перйодатом с образова­ нием альдегида (RCHOHCOOH —►RCHO), который легко опре­ делить с помощью ГХ, уже обсуждался выше. По этому поводу см. гл. 1, разд. II, Д.

В работе [29] описан анализ, в котором кислотные продукты окисления гексоз (полиоксимонокарбоновые кислоты) в щелочном растворе сначала превращали в лактоны действием НС1, триметилсилилировали гексаметилдисилазаном и триметилхлорсиланом, а затем уже анализировали методом ГХ.

Е. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КЕТОКИСЛОТ

Кетокислоты обычно удается определить методом ГХ после их превращения в подходящие производные по карбоксильной группе (см. гл. 3, разд. II, А). В анализе кислот цикла Кребса и родственных им соединений полезными в этом смысле оказались метоксимные производные кетокислот (в форме триметилсилильных эфиров) [30]. В другом методе [31] при анализе пировиноградной и а-кетоглутаровой кислот (которые в результате метанолиза с кислотным катализатором или обработки диазометаном могут образовывать два продукта) эти кислоты превращали в соответ­ ствующие хиноксалоны, обрабатывали бис-(триметилсилил) ацета­ мидом (БСА) и пиридином, а затем анализировали полученные производные методом ГХ

РСОСООН +

н

SUCH,),

Ж. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ

Важное значение белков и составляющих их аминокислот обу­ словило большой интерес к определениям аминокислот методом ГХ. Существуют различные методы автоматического анализа с использованием хроматографии на колонке, однако ГХ обеспечи­ вает более быстрый анализ и позволяет уменьшить величину ана­ лизируемой пробы. Было предложено большое число различных по типу производных, чтобы осуществить количественное определение двадцати аминокислот, обычно обнаруживаемых в белках. Выбор наилучшего производного осложняется большей частью тем, что эти аминокислоты содержат 1 2 различных функциональных групп, 4 желательно получить метод, применимый для анализа в???{

138 Глава 3

кислот. Методы, основанные на разложении, как правило, исклю­ чаются, поскольку разложение «стирает» характеристические раз­ личия между некоторыми из аминокислот. Наибольшие надежды связывают с недавних пор с методами, которые обеспечивают пол­ ное или по крайней мере воспроизводимое получение производ­ ных по полярным или нестабильным функциональным группам. Такие методы подробно обсуждаются в недавно опубликованной статье Блау [32] и потому здесь не рассматриваются.

Несколько методов, разработанных для анализа аминокислот и некоторых родственных их соединений, приведены в табл. 3.6.

Таблица 3.6

Характеристика некоторых из недавно опубликованных методов получения производных для количественных определений аминокислот методом ГХ

С о к р а щ е н и я . ТФА—трифторацетил; ТМС— триметилсилил; БСА—бис-(триметил- силил) ацетамид; БСТФА—бис-(триметилсилил) трифторацетамид.

1.Gehrke С. W., Stalling D. L., Separation Sci., 2, 101 (1967).

2.James G. P., Уan Dreal P. A., Clin. Chem., 15, 794 (1969).

3. Gehrke C. W., Zumwalt R. W., Wall L. L., J. Chromatog., 37, 398 (1968).

4.Crichton R. R..Leaf G., Biochem, J., 99 (3), 47R (1966).

5.Makisumi S., Sarofj H. A., J. Gas Chromatog., 3, 21 (1965).