книги из ГПНТБ / Инструментальные методы анализа функциональных групп органических соединений

V. РАДИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Д. Кэмпбелл

Наилучшими радиореагентами для определения карбонильной группы являются, как правило, меченые аналоги тех реагентов, которые широко применяются в обычных определениях. Особенно ценны такие радиореагенты, как меченые фенилгидразины, семикарбазид и тиосемикарбазид. Кроме них, используют также ра­ диоактивные изотопы серебра в присутствии щелочи: аммиачный раствор нитрата серебра с последующим добавлением элементар­ ного радиоактивного изотопа иода; цианид натрия (с гидролизом циангидрина или без него); тиосемикарбазоны, меченные радио­ активным изотопом серебра.

А. ПРЕВРАЩЕНИЕ В ЗАМЕЩЕННЫЕ ФЕНИЛГИДРАЗОНЫ

Из нескольких описанных в литературе радиохимических мето­ дов определения карбонильной группы, пожалуй, лишь один наи­ лучшим образом подходит для анализа заметных количеств низ­ комолекулярных соединений. Этот метод основан на обработке пробы га-иодфенилгидразином- 1311 и последующем разделении за­ мещенных фенилгидразонов с помощью жидкостной хроматогра­ фии в колонке [72] (гл. 1, разд. V). В работе [72] сообщается лишь о разделении производных о- и ж-нитробензальдегида, однако в принципе этот метод применим для определения любого карбонил­ содержащего соединения, которое количественно превращается в п-иодфенилгидразон, выделяемый с помощью жидкостной хрома­ тографии в колонке. Этот метод пригоден и для анализа смесей, если можно достаточно хорошо разделить соответствующие про­ изводные.

Распределение радиоактивности вдоль колонки регистрируют с помощью сцинтилляционного счетчика, который приводится в дви­ жение электроприводом и перемещается по колонке сверху вниз. Счетчик соединен с измерителем скорости поступления импульсов. На рис. 2.3 приведена радиохроматограмма разделения произ­ водных изомерных ароматических альдегидов (радиоактивность выражена в условных единицах, а расстояние отсчитывается от верха^ колонки).

Для того чтобы определить количество анализируемого произ­ водного, находящегося в колонке, используют известное количе­ ство некоторого производного карбонилсодержащего соединения, приготовленного с тем же радиореагентом, что и анализируемое производное, и на отдельной (сравнительной) колонке регистри­ руют стандартную хроматограмму. Сравнив площади хроматогра­ фических пиков анализируемого и эталонного производных, вы­ числяют искомое количество анализируемого производного. Основ­

ную и стандартную радиохроматограммы следует регистрировать одновременно, поскольку изотоп 1311 имеет небольшой период полураспада ( 8 дней).

Кважным преимуществам описанного метода относится то, что

сего помощью можно определить отдельные соединения в смеси,

если можно разделить соответствующие производные, а так же то, что радиохроматограмму можно регистрировать и во время проявления. Однако Wработе [72] не описаны ни методы количе­ ственного превращения карбонилсодержащих соединений в произ­ водные, ни методы отделения меченых производных от избытка реагента.

Рис. 2.3. Распределение радиоактивности вдоль хроматографической колонки [72]

Зона А: n-иодфенилгидразон-'’Ч о-нитробензальдегида; зона Б: п-иодфенилгидразон-ш1

.и-нитробензальдегида.

Принцип, лежащий в основе этого метода, можно реализовать с помощью хроматографии на бумаге и тонкослойной хроматогра­ фии с использованием для получения меченых соединений изо­ топа 3Н или, что лучше, изотопа 14С.

В работе [73] описано определение карбонильных групп, обра­ зующихся на поверхностях полиэтиленовых пленок под действием окислительной среды. Образцы при этом обрабатывали 0,01 М раствором 2,4-динитрофенилгидразина-14С в 2 н. серной кислоте. Избыток радиореагента смывали с пленки водой и затем измеряли остаточную радиоактивность поверхности пленки с помощью про­ точного газового детектора радиоактивности с тонким окошком. Для измерения удельной радиоактивности радиореагента некото­ рое небольшое его количество наносили на тот же образец исход­ ной пленки и тем же счетчиком измеряли радиоактивность. Если толщина определяемого образца пленки полиэтилена превышает длину пробега р-частиц, образующихся при распаде изотопа иС, то скорость счета на поверхности анализируемой пленки пропор­ циональна концентрации карбонильных групп. При анализе пле­ нок с толщиной, меньшей длины пробега р-частиц в полиэтилене,

необходимо учитывать [3-частицы, проникающие сквозь пленку с

другой стороны.

В работе [74] описана модификация метода прямого изотоп­ ного разбавления для образца, в котором радиореагентом яв­ ляется само определяемое соединение. Этот метод применяли для определения бензальдегида, используя 2,4-динитрофенилгидразон бензальдегида-14С. При использовании счетчика с жидким сцин­ тиллятором проявляется сильный эффект тушения, вызываемый нитрогруппами, и поэтому нитрозамещенные фенилгидразоны — неудачные реагенты для радиохимического определения карбонил­ содержащих соединений. Было показано [75], что эффективным способом преодоления этих затруднений является электролитиче­ ское восстановление нитрогрупп.

Б. ПРЕВРАЩЕНИЕ В я-БРОМФЕНИЛГИДРАЗОНЫ С ПОСЛЕДУЮЩЕЙ АКТИВАЦИЕЙ НЕЙТРОНАМИ

n-Бромфенилгидразоны, разделенные с помощью хроматогра­ фии на бумаге, можно определить прямо на хроматограмме, облу­ чив пятна этих производных и пятна стандартного бромсодержа­ щего соединения пучком горячих нейтронов. При этом два нера­ диоактивных изотопа брома превращаются в радиоизотопы с массовыми числами 80 и 82 соответственно:

7,!Br+J« —-SJBr + v

+^ > - + Y

Стабильные изотопы брома могут поглощать или «захватывать» нейтроны, и поэтому бром служит чувствительным индикатором в методе, который называют «хроматографией активированных про­ изводных» [76]. Количественный 'анализ этим методом ограничен активацией примесей в хроматографической бумаге; чувствитель­ ность метода составляет около 0 ,0 0 2 мкг при использовании гам- ма-сцинтилляциоцного счетчика. Для измерения радиоактивности после хроматографического проявления можно применять и жид­ костные сцинтилляционные счетчики, но при этом чувствитель­ ность метода будет меньше. Полностью возможности данного ме­ тода проявляются при работе с мощным источником нейтронов, таким, как, например, атомный реактор.

В. ПРЕВРАЩЕНИЕ В СЕМИКАРБАЗОНЫ, ТИОСЕМИКАРБАЗОНЫ И ГИДРАЗОНЫ

Сообщалось [77], что с помощью семикарбазида-14С в окислен­ ной целлюлозе можно определять малые концентрации карбониль­ ной группы в форме альдегида и в форме кетона в присутствии больших количеств карбоксильной группы.

114 Глава 2

Однако эта реакция не специфична для альдегидов, поскольку ме­ таллическое серебро образуется и с различными другими легко окисляемыми соединениями. При обработке хроматографической бумаги, содержащей разделенные восстанавливающие агенты, ни­ тратом серебра в аммиачной или щелочной среде в пятнах (хрома­ тографических зонах), соответствующих этим соединениям, обра­ зуется металлическое серебро. Количество образовавшегося сере­ бра измеряют обычными методами для измерения активности меченых соединений и сравнивают выходы серебра для анализируе­ мой и стандартных проб. Такой метод обеспечивает количественное определение микро- и полумикроколичеств соединений.

В первоначально опубликованном варианте этого метода [82] использовали изотоп UOmAg, который является источником у-излу- чения и имеет период полураспада, равный 253 дням. Хроматограм­ мы с анализируемыми соединениями погружали в раствор I10mAgNO3, высушивали и затем опрыскивали 0,5 н. раствором ед­ кого натра в водном этаноле для того, чтобы обеспечить щелочную среду реакции окисления. С обработанной хроматограммой следует обращаться осторожно, чтобы не допустить восстановления иона серебра хроматографической бумагой. Через определенный интер­ вал времени (продолжительность реакции или проявления) хрома­ тограммы погружают в разбавленный раствор аммиака для солю­ билизации окиси серебра и затем промывают их для удаления образовавшегося комплекса серебра с аммиаком. После этого из хроматограммы вырезают участки, содержащие металлическое се­ ребро, и измеряют их радиоактивность счетчиком Гейгера—Мюл­ лера. Данные для калибровки получают путем хроматографиро­ вания образцов стандартного раствора анализируемого соедине­ ния. Этот метод успешно применяли для определения от 0,017 до 0,22 мкМ альдегидной группы в глюкозе и галактозе и кетогруппы во фруктозе и сорбозе. Аналогичным методом определяли некото­ рые другие восстановители.

Реагент Толленса, который широко используют для опрыскива­ ния хроматограмм с целью качественного определения различных восстановителей, приготавливают так, чтобы избежать большого избытка аммиака, поскольку при высоких концентрациях свобод­ ного основания уменьшается чувствительность метода. В количе­ ственных радиохимических определениях альдоз, кетоз и других окисляющихся соединений с помощью ’хроматографии на бумаге концентрация серебра в реагенте должна быть гораздо выше той, которую используют в качественных определениях. Растворы, при­ меняемые в этом методе [83], приготавливают путем растворения 9—17 вес.% AgNCb в концентрированной гидроокиси аммония. По­ мимо высокой концентрации иона Ag+ в растворах, используемых в данном методе, должно быть также еще небольшое количество NaOH для воспроизводимого проявления пятен. После опрыскива­ ния хроматограммы нагревают при температуре 105 °С. Продолжи­

тельность нагревания определяется составом реагента. Избыток реагента Толленса удаляют, промывая хроматограмму сначала 0,02%-ным водным раствором аммиака, а затем водой. После про­ сушки хроматограммы погружают в подкисленный раствор К1311 и КЮз, где металлическое серебро под действием элементарного иода сразу же превращается в Ag131I. Для удаления непрореаги­ ровавшего 1311 хроматограммы вновь промывают водой.

Радиоактивность xp-оматограмм измеряют торцевым счетчиком Гейгера—Мюллера, используя щелевую диафрагму для измерения радиоактивности на выделенных небольших участках. Область про­ порциональности между полной радиоактивностью пятна и коли­ чеством соответствующего восстанавливающего агента следует определять отдельно для каждого анализируемого соединения. В быстрых ежедневных анализах удобнее использовать линейную зависимость максимума радиоактивности пятна от логарифма со­ держания в нем анализируемого вещества. При определении этим методом более 0,1 мкМ глюкозы и фруктозы относительные ошиб­ ки составляют ±6,7% и ±3,5% соответственно. На точность п воспроизводимость результатов анализа отрицательно влияет не­ равномерность распыления реагента по хроматограмме, что может приводить к серьезным ошибкам [84].

В результате тщательного изучения окислительных свойств растворов нитрата серебра в ацетоне, содержащих аммиак в экви­ молярных или меньших количествах [84], был разработан модифи­ цированный реагент Толленса, пригодный для радиохимических определений полумикроколичеств моносахаридов [85]. Растворы AgN03 в ацетоне, содержащие менее чем эквимолярные количества аммиака, обеспечивают большую чувствительность анализа, чем растворы, содержащие эквимолярное или большие количества этого основания. Наиболее эффективным окислителем оказался реагент, в котором отношение AgNC>3 к аммиачному AgN03 составляет 1:2. При использовании таких наиболее чувствительных реагентов хро­ матограммы несколько раз быстро погружают в раствор реагента и высушивают после каждого погружения. После последнего по­ гружения, не дожидаясь высыхания хроматограммы, пятна прояв­ ляют во влажной атмосфере при температуре 50 °С. Для удаления избытка реагента хроматограммы в течение непродолжительного времени обрабатывают 10%-ным раствором Na2S2C>3 и затем не­ сколько раз промывают водой. Высокая равномерность отложения металлического серебра и использование эффективного проявляю­ щего реагента приводят к повышению чувствительности метода и точности результатов анализа. Используя этот метод, глюкозу можно определить в количествах 0,008—0,06 мкМ. Для соедине­ ний, которые определяли этим методом, средние ошибки при изме­ рении в линейной области находились в интервале ± 1,1—4,2%. Чувствительность в значительной степени зависит от тщательности приготовления хроматографических растворителей.

Д. ПРЕВРАЩЕНИЕ В ЦИАНГИДРИНЫ ИЛИ КАРБОНОВЫЕ КИСЛОТЫ

Альдегиды, а также некоторые низкомолекулярные кетоны в различных условиях реагируют с цианистым натрием, образуя циангидрины. При необходимости циангидрины можно затем гидро­ лизовать до карбоновых кислот, содержащих на один атом угле­ рода больше, чем исходный циангидрин. Введение изотопа 14С в реагент (цианистый натрий) впервые использовалось при опре­ делении небольших количеств восстанавливающихся концевых групп в полисахаридах [8 6 ]:

Восстанавливающие сахара легко образуют циангидрин количе­ ственно. Так, например, первая работа в этой серии исследований показала, что реакция между стехиометрическими количествами NaCN и D-арабинозы в растворе (0,4 М по каждому из этих соеди­ нений) в основном завершается за 48 ч при температуре 20 °С. При этом для предотвращения разложения в реакционный раствор вво­ дят NaHC03 в качестве буфера [87].

Удельную радиоактивность Na14CN можно определить путем обработки определенного количества чистой глюкозы избытком реагента и измерения остаточной активности после улетучивания непрореагировавшего цианида из раствора, подкисленного муравьи­ ной кислотой [8 8 ]. Чтобы предотвратить разложение глюкозы едким натром, который обычно присутствует в растворах NaCN, реакцию ведут с добавлением буфера. На практике приго­ тавливают 20 ил 0,05 М раствора глюкозы и добавляют в него NH4Cl с таким расчетом, чтобы обеспечить 30%-ный избыток иона

NH4 по сравнению с ионом натрия. Этот раствор смешивают в за­ крытой пробирке с 0,003—0,010 мМ Na14CN, растворенного в 50 нл растворителя. Пробирку со смесью нагревают при температуре 55 °С в течение 24 ч. Затем из раствора удаляют цианид (в форме HCN), выпаривая его несколько раз досуха с 10%-ным раствором муравьиной кислоты, и измеряют радиоактивность остатка. Нелету­ чие радиоактивные примеси определяют этим же методом, но без добавления глюкозы.

Аналогичный способ определения удельной радиоактивности цианистого натрия, но без гидролиза циангидрина описан в работе [89] в связи с определением восстанавливающих сахаров и восста­ навливающих концевых групп в полисахаридах. Однако при этом использовали несколько другие условия, которые позволяли опре­ делять 0,0001—0,001 мМ сахара в присутствии двухкратного или трехкратного избытка цианида. В пробирку помещают 20 нл рас­ твора сахара (содержащего менее 0,001 мМ сахара) и добавляют 10 нл 0,6 М раствора NH4C1 и 10 нл раствора Na14CN, содержащего NaOH. Раствор реагента 0,26 М по цианиду и 0,5 М по иону натрия. Сразу же после добавления реагентов пробирку закрывают пробкой и нагревают в течение 24 ч при температуре 50—55 °С. Затем для удаления избытка цианида в пробирку добавляют 10%-ную мура­ вьиную кислоту, выпаривают раствор досуха при температуре 60 °С и проводят еще два цикла выпаривания с добавлением воды. Одно­ временно с описанным основным анализом аналогичным образом ведут анализ известного количества глюкозы с целью определения удельной радиоактивности цианида.

Рекомендовалось троекратно проводить анализ пробы, глюкозы и холостого раствора (для определения нелетучих радиоактивных примесей). Моносахариды альдозы и некоторые дисахариды погло­ щают 1 моль цианида на 1 моль сахара. При анализе сахаров и полисахаридов, поглощающих более 1 экв цианида, необходимо проводить определения контрольных образцов, содержащих извест­ ные количества этих соединений. В 24 определениях глюкозы этим методом средний разброс результатов составлял ±1,4%. При анализе декстранов с концевыми восстанавливающими группами этот метод (с NaHC03 в качестве буфера, при комнатной темпе­ ратуре) дал результаты, которые достаточно хорошо согласовыва­ лись с результатами, полученными обычными химическими ме­

тодами.

Эффективность этого метода была продемонстрирована и его применением для оценки 1,3'- и 1,4'-связей в декстранах после окисления перйодатом и гидролиза [90]. В этом анализе D-глюкозу, образованную из структур с 1,3'-связями, и D-эритрозу, образован­ ную из структур с 1,4,-связями, превращали в меченые циангид­ рины, которые затем подвергали гидролизу до солей щелочных металлов о-глицеро-о-гулогептоновой и D-арабоновой кислот соот­ ветственно. Гидролиз осуществляли в присутствии избытка цианида без выделения промежуточных продуктов. Перед выделением и пе­ рекристаллизацией полученных производных в раствор добавляли в качестве носителей соли щелочных металлов этих кислот. Для проведения калибровки известные количества d -г л ю к о зы и D-эри-

трозы обрабатывали тем же количеством меченого реагента, затем добавляли в растворы определенные количества указанных выше носителей и сравнивали удельные радиоактивности солей, выделен­ ных из анализируемой и из стандартных проб.

Е. ПРЕВРАЩЕНИЕ НЕАКТИВНЫХ ТИОСЕМИКАРБАЗОНОВ В ПРОИЗВОДНЫЕ, СОДЕРЖАЩИЕ РАДИОАКТИВНЫЙ ИЗОТОП СЕРЕБРА

Сообщалось [77], что небольшие количества карбонильной груп­ пы, содержащиеся в окисленной целлюлозе, можно определить пу­ тем обработки анализируемой пробы нерадиоактивным тиосемикарбазидом с последующим удалением избытка реагента и добав­ лением nomAgN03:

R—CH=N —NH—С—NH2 + 1IOm+ Ag — v R—CH=N —N=C—NH2 + H+

Для образования производного серебра необходимы условия, при которых не оказывает мешающего действия карбоксильная группа, присутствующая в продукте реакции. Реагируя с тиосемикарбазидом и тиосемикарбазонами, нерастворимые соединения образуют также медь и ртуть.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

АБСОРБЦИОННЫЕ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

1. Barthauer G. L., Jones F. V., Metier A. V., Ind. Eng. Chem., Anal. Ed., 18,

354 (1946).

2.Rees H. L., Anderson D. H., Anal. Chem., 21, 989 (1949).

3. Englis D. T., Hanahan D. J., Ind. Eng. Chem., Anal. Ed., 16, 505 (1944).

4.Englis D. T., Manchester M., Anal. Chem., 21, 591 (1949).

5.Pepe J. J., Kniel /., Czuha M., Jr., Anal. Chem., 27, 755 (1955).

6.Mathewson W., J. Am. Chem. Soc., 42, 1277 (1920).

7.Toren P. E., Heinrich B. J., Anal. Chem., 27, 1986 (1955).

8.Lohman F. H., Anal. Chem., 30, 972 (1958).

9.Lappin G. R., Clark L. C., Anal. Chem., 23, 541 (1951).

10.Mendelowitz A., Riley J. P„ Analyst, 78, 704 (1953).

11.Jordan D. E., Veatch F. C., Anal. Chem., 36, 120 (1964).

12.Johnson G. R. A., Scholes G., Analyst, 79, 217 (1954).

13.Basson R. A., -Anal. Chem., 38, 637 (1966).

14. Feigl F., Spot Tests in Organic Analysis, 7th Ed., Elsevier, Amsterdam, 1966,

p. 434.

15.Eegriwe E., Z. Anal. Chem., 110, 22 (1937).

16.Boyd M. J., Logan M. A., J. Biol. Chem., 146, 279 (1942).

17.Bricker С. E., Johnson H. R., Ind. Eng. Chem., Anal. Chem., 17, 400 (1945).

18.McFayden D. A., J. Biol. Chem., 158, 107 (1945).

19.Bricker C. E„ Vail W. A., Anal. Chem., 22, 720 (1950).

20. Still R. H„ Wilson K., Lynch B. W., Analyst, 93, 805 (1968).

21. Tobie W. C., Ind. Eng. Chem., Anal. Ed., 14, 405 (1942); Food Res., 6, 15 (1941).

22.Segal L„ Anal. Chem., 23, 1499 (1951).

23.Scott F. C„ Analyst, 70, 374 (1945).

24.Kramm D. E., Kolb C. L., Anal. Chem., 27, 1076 (1955).

25.Hoffpauir C. L., O’Connor R. T., Anal. Chem., 21, 420 (1949).

26.Fishbeck K., Neundeubel L., Z. Anal. Chem., 104, 81 (1936).

27.Deniges G., Compt. Rend., 150, 529 (1910).

31.Dal Nogare S., Norris T. 0., Mitchell J., Jr., Anal. Chem., 23, 1473 (1951).

32.Cochran E., Reynolds C. A., Anal. Chem., 33, 1893 (1961).

33.Goddu R. F., Anal. Chem., 30, 1707 (1958).

ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

34.Bierl В. A., Beroza M„ Ashton W. T., Mikrochim. Acta, 1969, 637.

35.Осокин Ю. Г., Фельдблюм В. С., Крюков С. И., Нефтехимия, 6, 333 (1966).

36.Regnier F. Е., Huang J. С., J. Chromatog. Sci., 8, 267 (1970).

37.Harrison S., Analyst, 92, 773 (1967).

38.Carlson D. G., Tallent W. H., J. Chromatog. Sci., 8, 276 (1970).

39.Perry M. B., Webb A. C., Can. J. Biochem., 46, 1163 (1968).

40.Tamura Z., Imanari T., Arakawa Y., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo), 16, 1864

(1968).

41. Schogt J. С. M., Begemann P. H., Recourt J. H., J. Lipid Res., 2, 142 (1961).

42.Rao P. V., Ramachandran S., Cornwell D. G., J. Lipid. Res., 8, 380 (1967).

43.Metwally M. M. E., Amundson С. H., Richardson T., J. Am. Oil. Chemists’ Soc., 44 (3), 136A (1967).

44.Karmen A., J. Lipid Res., 8, 234 (1967).

45.Ralls J. W„ Anal. Chem., 36, 946 (1964).

46.Jones L. A., Monroe R. J., Anal. Chem., 37, 935 (1965).

47.Nishi S., Tokyo Kogyo Shikensho Hokoku, 60, 344 (1965).

48.Hunter I. R., Walden M. K., J. Gas Chromatog., 4, 246 (1966).

49. Gadbois D. F., Scheurer P. G., King F. J., Anal. Chem., 40, 1362 (1968).

50.Stanley W. L., Ikeda R. M., Vannier S. H,, Rolle L. A., J. Food Sci., 26, 43 (1961).

51.Ronkainen P., Brummer S., J. Chromatog., 28, 253 (1967).

54.Stevens R. D., Van Middelem С. H., J. Agr. Food Chem., 14, 149 (1966).

55.Fales H. M., Luukkainen T., Anal. Chem., 37, 955 (1965).

59.Balint T., Szepesy L„ J. Chromatog., 30, 433 (1967).

60.Senn M., Richter W. J., Burlingame A. L„ J. Am. Chem. Soc., 87, 680 (1965).

ЭЛЕКТРОАНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

61.Zobov E. V., Lyalikov Yu. S., Chem. Abstr., 52, 1443lh (1958).

62.Berka A., Dolezal J., Janata J., Zyka J., Anal. Chim. Acta, 25, 379 (1961).

63.Laitinen H. A., Burdett L. W., Anal. Chem., 22, 833 (1950).

64.Kolthoff I. M., Lingane J. J., Polarography, 2nd Ed., Interscience, New York,

1952; Meites L., Polarographic Techniques, 2nd Ed., Interscience, New York,

1965.

65. Elving P. J., Rutner E., Ind. Eng. Chem., Anal. Ed., 18, 176 (1946).

66.Van Atta R. E., Jamieson D. R., Anal. Chem., 31, 1217 (1959).

67.Krivis A. F., Supp G. R., Anal. Chem., 35, 1411 (1963).