ФХНМ часть3 / Rempel ФХНМ-Л41
.pdfФизико-химия наноструктурированных материалов
Лекция 4.1. Флуоресцентная оптическая
микроскопия
Понятия оптической и конфокальной микроскопии. Микроскопия дальнего и ближнего полей. Оптическая микроскопия со стимулированным подавлением эмиссии STED. Методы возбуждения флуоресценции. Фотолюминесценция. Спектры возбуждения и эмиссии. Фильтры для флуоресцентной оптической микроскопии. Подготовка биологических образцов для исследования на флуоресцентном микроскопе. Цифровое фотографирование флуоресцирующих объектов, предел разрешения.
Профессор Ремпель А.А., член-корреспондент РАН, ИХТТ УрО РАН
Микроструктура твердых тел
Методы исследования структуры.
Пространственное разрешение
•Оптическая микроскопия (200 нм-100 мкм).
Поляризационная, флуоресцентная, конфокальная
•Зондовая микроскопия (10-500 нм).
Атомно-силовая, оптическая микроскопия ближнего поля.
•Дифракция рентгеновских лучей (0.1-100 нм).
Уширение дифракционных пиков, рассеяние скользящих рентгеновских лучей, рефлектометрия, малоугловое рассеяние
•Сканирующая электронная микроскопия (1 нм-10 мкм)
•Просвечивающая электронная микроскопия ( 0.1-100 нм)
•Аннигиляция позитронов (0.1-100 нм)
Свойства и практическая важность
исследуемых материалов
1.Микротвердость, твердые сплавы, металлообработка
2.Флуоресценция, лазеры, биометки, фотодатчики, передача информации на большие расстояния
3.Устойчивость к облучению высокоэнергетическими частицами, атомная энергетика
4.Цветные метки для исследования структуры клеток
5.Фотокатализ, окисление органических веществ, расщепление воды на водород и кислород
Классификация оптических микроскопов
По областям применения
•биология и медицина
•материаловедение
По строению оптической схемы:
-прямыемикроскопы (объективы, наблюдательная насадка и окуляры расположены над объектом -инвертированные микроскопы (объект находится над оптической частью, формирующей изображение);
-стереомикроскопы, содержащие в своей оптической схеме два расположенных под углом друг к другу микроскопа, формирующие объемное изображение объекта, объект располагается под оптической частью, формирующей изображение.
Классификация оптических микроскопов
Эти три основных класса разделяются параллельно по двум схемам:
-по способам освещения;
-проходящего света
-отраженного света,
-по методам контраста: -светлого поля, на светлом фоне выделяется более темный объект; -темного поля, на темном фоне выделяется светлый объект или его краевые cтруктуры; -фазового контраста, на светло-сером фоне наблюдается темно-серый рельефный объект. Объек тпрактически всегда сильно оконтурен; -косогосвета, на относительно сером фоне наблюдается контрастное, более темное изображение с игрой светотени на контурах;
-флуоресценции (люминесценции, эпилюминесценции), на темном фоне выделяются светящиеся объекты или части объекта;
-поляризованного света, наблюдается ярко окрашенное в различные цвета или оттенки изображение объекта;
Разрешающая способность микроскопа,
критерий Релея
Под разрешающей способностью микроскопа обычно понимают возможность различения двух близких по интенсивности точечных объектов. Из вида функции распределения интенсивности в фокальной плоскости следует, что разрешение будет определяться степенью перекрытия пятен Эйри, т.е. распределений двух точечных объектов. Релеем был предложен критерий, согласно которому две точки считаются разрешенными, если величина "провала" в интенсивности по центру между изображениями точек составили26% от максимума. При этом расстояние между разрешаемыми точками должно быть больше радиуса пятна Эйри.
Оптическая микроскопия
Пространственное разрешение R λ – длина волны
n – показатель преломления u – апертура
Разрешение не лучше, чем 200 нм
R 1.22 2n sin u
•Достоинства метода
•Недостатки метода
Возможности микроскопа Leica DM 2500 M
•Цифровая съемка с увеличением более 1000 раз
•Наилучшее разрешение микроскопа около 500нм
•Наблюдение различных фаз с помощью
поляризации света
•Наблюдение флуоресценции при облучении в
ультрафиолетовом и фиолетовом диапазонах
Морфология зерен в монооксиде титана
10 µm