
- •1. Основные представления о микробиологических средах и их компонентах
- •1.1. Классификация сред, терминология
- •1.2. Питательные основы
- •1.3. Агар-агар и его заменители
- •1.4. Сыворотка крови животных и человека
- •1.5. Твины
- •1.6. Минеральные соли
- •1.7. Селективные агенты Красители
- •2. Грамотрицательные аэробы 2.1. Род Псевдомонады
- •2.2. Сем. Нейссерии
- •2.3. Род Бордетеллы
- •2.4. Род Бруцеллы
- •4.3. Сем. Пастереллы Род Пастереллы
- •8.4. Род бациллы
- •8.5. Род микобактерий
1.4. Сыворотка крови животных и человека
Сыворотка крови богата биологически активными соединениями, значение многих из которых в отношении микроорганизмов неясно. Она является также одним из источников железа, необходимого для многих видов бактерий. Особенности сыворотки крови разных видов животных и человека хорошо изучены. Показаны различия в белковом составе (Кармолиев Р. X., 1971) и других биохимических свойствах (Радаева И. Ф., Костина Г. А, 1998). При культивировании микобактерий для обогащения жидких питательных сред используют сыворотку крови различных видов млекопитающих. В нативном состоянии ее рекомендуют включать в среду для культивирования L—форм микобактерий туберкулеза Дорож-кова И. Р., Волк А. В. (1972) и Мордовской Г. Г., Птицына Е. А. (1982). По данным Mysak J. (1974) среда Банич с добавлением 10% сыворотки крови превосходит по культуральным свойствам среды
12
13
Левенштейна-Иенсена
и Шула. Максимальное улучшение
культу-ральных
свойств жидких питательных сред
отмечается при использовании
крови (Dickinson
J.
et
al.,
1989) и сыворотки крови крупного
рогатого скота (КРС) или V
фракции бычьего сывороточного альбумина
(БСА). Это среда Школьниковой с 10%
сыворотки крови КРС и среда Миддлбрука
(Middlebrook)
без агара, но с добавлением
комплекса олеин-альбумин-декстроза-каталаза.
Хранениекоммерческих
сред, содержащих V
фракцию БСА, ухудшает их культуральные
свойства (Culter
S.,
1988). Бибергаль В. А. (1991) показала
улучшение культуральных свойств среды
Школьниковой в 9
раз при добавлении свежей человеческой
плазмы. Можно, по ее мнению,
использовать для этого и инактивированную
сыворотку крови
КРС. По данным Ильиных Л. А. (1990) при
добавлении сыворотки крови КРС в
среду Гельберга отмечается более ранний
и интенсивный рост колоний микобактерий.
Свежая сыворотка крови
КРС в среде Middlebrook
7H11
ускоряла рост М. bovis
(Galaciner
J.,
Horwill
D.,
1977). Сыворотку крови КРС содержит среда
Ренжа-ра для
культивирования М. paratuberculosis
(цит. по Сидорову М. А. и
соавт., 1995). Среду для выделения
микобактерий, содержащую сыворотку
крови лошади, предлагают Дудницкий И.
А. и соавт. (1991).
Dhople
A.
et
al.
(1996) отмечают стимулирующий эффект на
рост М. avium
добавления в бульон 7Н9 сыворотки крови
кроликов и
людей, больных гемолитической анемией
и гемохроматозом; тогда как сыворотки
крови здоровых людей и больных
микобактери-озом, вызванным М. avium,
наоборот, оказывали угнетающее действие.
Сыворотка крови лошади входит в состав
среды ML
для культивирования
М. leprae
(Osawa
N.,
1997). Среда VS3E,
содержащая
30% сыворотки крови плода коровы (Bhatia
V.,
Rao
S.,
1989), поддерживает рост М.leprae.
Нативную сыворотку крови лошади используют в питательных средах для пневмококков Балаян Л. Б. (1947); Бухарин О. В. и соавт. (1981).
Сыворотка крови входит в состав сред для нейссерий (Лабин-ская А. С, 1972; ГаджиеваА. Г. и соавт, 1982), в том числе менингококков (Руководство..., 1973; Шичкина В. П. и соавт., 1983). Общепринято выделение и культивирование последних на агаровых средах с 20% сыворотки крови лошади (Игонина Ю. А. исоавт., 1976; Костюкова Н. Н. и соавт., 1980). Используется и сыворотка крови КРС (авт. свид-во № 1659485, 1991). Учитывая процентное соотношение белков в асците, Андреева 3. М., Боб-ровникова А. Я. (1984) заменили его в соответствующих питательных средах для нейссерий сывороткой крови лошади. При этом, как отмечалось выше, ростовой эффект 1%-ой сыворотки объяснялся нейтрализацией ею токсического компонента агара.Шичкина В. П. и соавт. (1983) вводили в среду 13—20% сыворотки крови животных. Татарников В. М. и соавт. (1984) показали низкую высеваемость менингококка на среде Гаджиевой в сравнении с 20%-ым сывороточным агаром Хоттингера и рекоменду-
ют добавлять в среду 10% нативной сыворотки крови лошади.
Османова М. М. и соавт. (1987) на жидких средах с разным содержанием сыворотки крови КРС показали защитный и стимулирующий механизм действия ее на рост гонококков. В результате оптимизации процесса культивирования получен рост тест-штаммов в бессывороточных средах. N. meningitidis формируют поли-сахаридную капсулу на плотных средах с добавлением нативной сыворотки, белки которой, однако, являясь балластными примесями, затрудняют процессы выделения и очистки препаратов, содержащих капсульный полисахарид. Скляр Т. В. и соавт. (1997) считают возможным замену в среде для культивирования N. gonorrhoeaeсыворотки крови КРС на плазмол. Сыворотка крови человека и животных улучшает рост бледных трепонем. По данным Tokahashi К. et al. (1987) сыворотки крови человека и свиней инги-бируют активность гемолизина Т. hyodysenteriae.
Сыворотка крови млекопитающих удовлетворяет пищевые потребности большей части патогенных видов микоплазм в протеине, стероле, фосфолипиде и ацетонрастворимом липиде (Каган Г. Я., Раковская И. В., 1968). Наиболее широко используются для культивирования среды, обогащенные нативной сывороткой лошади. Выявленную непригодность сыворотки крови КРС Башмакова И. А., Солдатова В. М. (1971) связывают с низким содержанием в ней холестеринов и липидов. Кроме того, по их данным сыворотка крови человека эффективнее для выделения микоплазм.
Сыворотка крови лошади используется в среде для выделения Ureaplasmaurealyticum(Гаджиева Г. Р. и соавт., 1989) и в средеU-9 (RaddiM.etal., 1992). Ее содержание в средах для микоплазм колеблется от 5 до 20% (Зуев В. В., 1971; Жеверже-ева И. В. и соавт., 1983; Барышникова П. И., 1994;SikdarA.etal., 1992).
FerreiraN. (1993) допускает при инкубации М.gallisepticumна средах ТР иSSзамену лошадиной сыворотки крови свиной, хотя 1-ая для дифференциации штаммов и анализа белков в ЭПАГ оказалась предпочтительней. Билько И. П. (1975) рассматривает использование сыворотки крови в питательных средах для получения биомассы микоплазм как отрицательное явление, вследствие необходимости многократного отмывания и концентрирования ее для освобождения от белков сыворотки. Эффективной для выделения гемокультур микоплазм оказалась среда Клодницкого с 0,01 %-ым цистином без добавления сыворотки крови животных (Клодницкая С. Н., 1976). О возможности культивирования М.canadenseи М.verecundumв питательной среде для микоплазм без сыворотки, но с БСА, сообщаютGracielaM.,Sotomayor P. (1990), хотя интенсивность роста при этом была ниже.BreardA. (1990) рекомендует синтетический заменитель сыворотки крови при молекулярно-биологических исследованиях, но не для получения антигенов у микоплазм. По даннымOkasa-
14
15
ki
N.,
Fujiwara
K.
(1992) отдельные виды микоплазм чувствительны
к микоплазмоцидному действию сыворотки
крови лошади. Наибольшая активность
выявлена по отношению к М.pneumoniae.
Эффект проявлялся при 37°С в присутствии
Са2+
и Mg2+.
После прогревания при 56°С в
присутствии комплемента эффект
сохранялся в отношении М.pneumoniaeи М.fermentans, но не вотношении
М. neurolyticum
и М. laidlawii.
Установлено, что эта активность
определяется комлексомlgGи М.
Сыворотка кроличьей крови в концентрации 5—30% является основным компонентом питательных сред для лептоспир. Малахов Ю. А. (1992) рекомендует использовать для их культивирования сыворотку крови животных только двух видов: кроликов иовец. Сыворотки крови КРС, баранов, лошадей и свиней обладают бактерицидным действием по отношению к лептоспирам(Ананьина Ю. В., Чернуха Ю. Г., 1983; 1984). Наиболее активно росту этих микроорганизмов способствует альбуминовая фракция. Некоторые исследователи рекомендуют использовать гемо-лизированную сыворотку, отмечая улучшение роста лептоспирпри определенной степени гемолиза. Сыворотка крови или альбумин используются для детоксикации твинов в питательной среде.
Первоначально в нашей стране при промышленном производстве вакцины против лептоспироза микроорганизмы культивировали в среде Уленгута, состоящей из воды и кроличьей сыворотки крови. Замена в дальнейшем этой сыворотки на овечью не снизила качества вакцины. Однако переход в 1966 году биофабрики на альбуминовую среду ВГНКИ-1, где сыворотка была заменена ее альбуминовой фракцией вызвал ухудшение антигенных свойств лептоспир и с 1975—1976 годов для культивирования вновь стали использовать водно-сывороточную среду с овечьей сывороткой. Затем было установлено отрицательное влияние на рост лептоспир спонтанно встречающихся в сыворотках крови овец-доноров гомологичных антител и на биофабрике внедрили комбинированную сывороточно-альбуминовуюсреду, которую применяют и в настоящее время (Ситьков В. И. и соавт., 1996). За рубежом же для этих целей используют бессывороточные полусинтетические (альбуминовые) или синтетические питательные среды.
Сыворотку крови различных видов млекопитающих добавляют в среды для спорификации патогенных и непатогенных микробов (Sementini А., 1942), в частности, В. anthracis (Srinivasan V. et al., 1972). Кровь и ее сыворотка адсорбируют ингибиторы капсу-лообразования питательной среды (Schaefer W., 1963). Роль последней в образовании капсул у вирулентных штаммов В. anthracis изучали Meynell E., Meynell G. (1964). Нативные бычья или лошадиная сыворотки в относительно высокой концентрации являются обязательными компонентами многих элективных сред, предназначенных для капсулообразования В. anthracis (ГКИ; Томова; Шляхова, 1973; Низамова Р. Н. и соавт., 1992; Лефлера; сыворо-
точных агара и бульона). Левина Е. Н. и соавт. (1974) с целью накопления токсина В. cereus использовали среду Торна с добавлением, помимо других компонентов, 1% сыворотки крови.
Кровь КРС, а чаще ее сыворотка, входят в состав питательных сред для культивирования бруцелл (Колесникова Н. С, 1961; Альтон Дж., Джонс Л., 1968). Как заменитель сыворотки для повышения ростовых качеств среды для бруцелл используют твин-40. В отличие от других (шероховатых форм) бруцелл штамм Br. ovis И-65 (гладкий вариант) растет только на питательных средах с нативными сыворотками крови КРС или лошади (Тарасова Т. А. и соавт., 1983).
Для культивирования Campylobacterpyloriиспользуют различные кровяные среды с добавлением 5—10% бараньей, лошадиной или человеческой крови и (или) сыворотки (Баженов Л. Г., 1991). Xia H. et al. (1992, 1993) отмечают, что в сердечно-мозговом бульоне с 10% лошадиной сыворотки крови С.pyloriсохраняются более 3 сут.SchulzeEetal. (1987) выделяли и дифференцировали бактерии родаCampylobacterна агаре Мюллера-Хинтона (Mueller-Hinton) с добавлением 10% телячьей крови.
Allan Е., Poxton 1. (1994) показали влияние среды культивирования на чувствительность различных видовBacteroidesк бактерицидному действию комплемента сыворотки крови человека и экспрессию поверхностных структур. Изученные штаммы былив различной степени чувствительны к сыворотке когда культивировались в обогащенной среде с протеозным пептоно-дрожже-вым экстрактом. Однако при выращивании в минимальной среде Van Tassell и Wilkins, половина штаммов проявляла ощутимую устойчивость как к человеческой, так и к инактивированной бараньей сывороткам крови.
Для культивирования возбудителя американского гнильца пчел (Вас. larvae) в настоящее время широко используют МПА с добавлением 10% лошадиной сыворотки крови без консерванта,хотя и на ней Вас. larvae не всегда хорошо растет.
Савельев Е. П. и соавт. (1989) изучали влияние на рост стрептококков группы А добавления в среду культивирования фракций сыворотки крови КРС, содержащих низкомолекулярные соединения. Griffiths В., McClain О. (1987) показали восстановление инга-бированной ионами Fe3+ продукции гемолизинов Str. pyogenes при добавлении в среду сыворотки. По даннымShimokawaО.etal.(1994) сыворотка крови лошади подавляет рост L-форм St. aureus, а редкие колонии, выраставшие на среде, обогащенной даннойсывороткой, являются стабильными L-формами. Ivanova E. et al. (1991) культивировали стабильные L-формы протопластов Е. coli WE+на соевой среде с 10% сыворотки.
По данным EvansM.etal. (1986) добавление сыворотки крови человека к бульону Мюллера-Хинтона приводит к появлению14—50% ложноположительных результатов чувствительности Ps. aeruginosaк моксалактаму. Значительно возрастает чувствитель-
16
I7
ностьPs.aeruginosaк
сыворотке крови человека при выращивании
наMg-дефицитной среде
(TzouvelekisL.etal., 1990).
Кравцов А. Н. и соавт. (1987, 1992) показали связь остановки роста Y. pestis в нативной сыворотке крови с ограничением поступления железа в микробную клетку. Выяснено, что гемин Y. pestis в сыворотке не используют. Предполагается ассимиляция железа трансферрина зависящая от температуры и осуществляющаясятолько при 28°С. Инкубация в сыворотке крови человека способствует обогащению антигенной структуры возбудителя чумы, повышая тем самым вирулентность и иммуногенность.
Пастереллы на средах без сыворотки растут не всегда удовлетворительно, поэтому в бактериологической диагностике пасте-реллеза рекомендуется использование сывороточных МПА иМПБ, а также сывороточных бульона и агара Хоттингера в состав которых входят 10% нативной сыворотки крови лошади (Метод, указания ..., 1992).
Наличие цистиназы—основного видового признака С. dipt-heriae—определяют на среде Пизу с 10% лошадиной сыворотки. Батурина А. В. и соавт. (1990) заменили в ней лошадиную сыворотку на среду 199. Отсутствие сыворотки крови в агаровой среде не сказывается на качестве тестирования токсигенности дифтерийных культур, причем наилучшей из заменителей сыворотки (твин-40, ГЛА, аминопептид, протеин) оказалась среда 199 (Гази-зова Г. Р. и соавт., 1990).
Сидоров М. А. и соавт. (1995) отмечают лучший рост актино-мицетов A. pyogenes и A. hardeovulneris на сывороточных средах. Сыворотка крови кролика входит также в состав среды Бейгтона, Колмана (1976).
Пушкарева В. И. и соавт. (1997) показали реверсию покоящихся листерий в вегетативное состояние под воздействием фе-тальной сыворотки.
CastanedaE.etal. (1988) отмечают эффективность наличия в среде культивирования лошадиной сыворотки крови при выделении Paracoccidioides brasiliensis и объясняют это содержанием в ней сидерофоров.
Поданным Ожередовой Н. А. (1997) стимулирующий эффект сыворотки крови рыб на рост и размножение С. albicansвыше, чем кроличьей.