3. 3.3. Исследования эпр суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в водных растворах

Цель исследований:исследования спектров ЭПР суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в водных растворах в зависимости от их размера и концентрации

Объекты исследований: суперпарамагнитные наночастицы оксида железа в дистиллированной воде и водных физиологических растворах.

Исследуемые параметры:ширина и форма линий ЭПР наночастиц оксида железа.

Методы определения: измерение спектров ЭПР методом стационарной ЭПР-спектроскопии 3-см диапазона.

Приборные средства измерений:Малогабаритный спектрометр электронного парамагнитного резонанса моделиESR-MINI3-см диапазона. Все измерения осуществлялись в стандартных стеклянных ампулах (капиллярах) диаметром 1,5 мм без вращения. В качестве реперного образца использовался образец дифенил-пикрил-гидразила (ДФПГ) с g-фактором 2,0036.

Параметры регистрации спектров ЭПР:частота ВЧ модуляции 100 кГц, амплитуда модуляции - 5 Гс, мощность СВЧ - 2 – 8 мВт, коэффициент усиления - варьировался, количество сканирований – 1.

Содержание работы:

5. Синтез суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в гетерофазных условиях из растворов двух и трехвалентного железа по схеме Элмора-Массарта.

6. Измерение спектров ЭПР водных растворов магнитных наночастиц оксида железа.

Экспериментальные результаты исследований.

На рис.47-49 представлены спектры ЭПР магнитных частиц Fe₃O₄в тонкой гекстрановой оболочке в дистиллированной воде. Условия регистрации спектров ЭПР: частота СВЧf₀ = 9,52 ГГц, мощность СВЧ облучения – 2 мВт (для образцов 1 и 2) и 8 мВт (для образца 3); коэффициент усиления – 400 (для образца 1) и 800 (для образцов 2 и 3).

Для этих спектров характерно наличие двух раздельных сигналов с g- факторами

g₁= 2,32 иg₂= 4,19 , что обусловлено существованием двух конфигураций комплексов железаFe³⁺(3d⁵) иFe²⁺(3d⁶), соответственно. Проведенные нами исследования ЭПР показывают, что форма спектров ЭПР сильно зависит от технологии приготовления образцов, от концентрации и размера наночастиц железа в растворе.

Рисунок 47. Спектры ЭПР оксидов железа в дистиллированной воде (С_Fe = 10,6 мM/л).

Рисунок 48. Спектры ЭПР оксидов железа в дистиллированной воде (С_Fe = 2,6 мM/л).

Рисунок 49. Спектры ЭПР оксидов железа в дистиллированной воде (С_Fe = 1,3 мM/л).

Результаты исследований ЭПР наночастиц оксида железа в дистиллированной воде и водных физиологических растворах (использовался фосфатный буфер с pH = 7,0) в зависимости от концентрации и размера наночастиц, представлены на рисунках 50 - 52.

Рисунок 50. Спектры ЭПР суспензии наночастиц оксида железа в дистиллированной воде. Концентрация Fe3+: 1) – 10,5 ммоль/л, 3) – 19,0 ммоль/л, 4) – 31,25 ммоль/л, 5) – 75,9 ммоль/л.

Рисунок 51. Спектры ЭПР суспензии наночастиц оксида железа в физиологическом растворе. Размер наночастиц - менее 200 нм.

Рисунок 52. Спектры ЭПР суспензии наночастиц оксида железа в физиологическом растворе. Размер наночастиц – более 200 нм.

Сравнительный анализ спектров ЭПР суспензий наночастиц оксида железа как в дистиллированной воде, так и в водных физиологических растворах показывает следующие закономерности:

- с ростом концентрации наночастиц оксида железа происходит увеличение интенсивности и «эффективной» ширины сигналов ЭПР;

- форма линий ЭПР содержит две компоненты – узкий и широкий сигналы, накладывающиеся друг на друга.

Похожая форма линий ЭПР наблюдалась также в исследованиях ЭПР жидких (вода и толуол) и твердых (полимер) суспензий суперпарамагнитных частиц γ-Fe2O3, выполненных группой Ногиновой Н. [61], которые соотнесли данный спектр агрегатам частиц, образуемым в суспензиях.

Нами был проведен сравнительный анализ экспериментальных спектров ЭПР наночастиц оксида железа с моделированными спектрами ЭПР агрегатов металлических наночастиц в коллоидных растворах, полученными Долотовым C..В. и Ролдугиным В.И.[62-64].

В работах [62-64] использован подход, позволяющий моделировать агрегаты с наперед заданной фрактальной размерностью.

В рассматриваемом подходе структура агрегата задается величинами фрактальной размерности и префактора. Построение агрегата осуществлялось путём присоединения одиночных частиц. С использованием этих моделей были построены двух- и трёхмерные агрегаты моно- и полидисперсных наночастиц, содержащие различное число частиц и обладающие различной фрактальной размерностью (рис. 53).

Рисунок 53. Схема построения фрактального агрегата.

При расчёте спектров ЭПР учитывали только наиболее существенное диполь-дипольное взаимодействие спинов электронов, принадлежащих разным частицам. В этом случае магнитные дипольные моменты μ_i, наведенные на различных частицах, подчиняются системе уравнений

(4)

где индексы i иj нумеруют частицы, α , β - указывают компоненты

векторов в прямоугольной системе координат, α ,β = {x,y,z}, χ₀– восприимчивость изолированной частицы,r_ij =r_i −r_j ,n_ij =r_ij /r_ij ,i r_i – радиус вектор центраi -ой частицы,H_i⁽⁰⁾– внешнее поле в точке ее расположения.

Система уравнений (4) разрешается, и, с учётом выражения для восприимчивости отдельной частицы, получается выражение для расчёта спектров ЭПР агрегатов металлических наночастиц

, (5)

гдеω₀– резонансная частота,g – электронныйg -фактор, β – магнетон Бора, ћ - постоянная Планка, τ_i- время релаксацииi -й частицы,U_iαⁿ иw_n - собственные векторы и собственные значения 3N -мерной матрицыW с элементами

,(6)

,.

С помощью соотношений (4-6) были рассчитаны спектры ЭПР построенных агрегатов, в том числе и спектры ЭПР анизотропных агрегатов при различной ориентации внешнего магнитного поля.

В случае полидисперсных наночастиц расчёты были проведены для фрактальных агрегатов, состоящих из 100 частиц, размер которых распределён по нормальному закону при среднем диаметре частиц, равном 10 нм. Приведём спектры для наиболее типичного случая агрегатов с d_f =2.2.

При малых значениях среднего квадратичного отклонения σ в спектре наблюдается две накладывающиеся друг на друга линии ЭПР. Когда σ = 0.3 нм, в спектре остаётся только одна линия ЭПР (рис. 54).

Рисунок 54 - Спектры ЭПР фрактальных агрегатов (d_f = 2.2), состоящих из полидисперсных частиц, при различных значениях σ : 1 – 0, 2 – 0.1, 3 – 0.2, 4 – 0.3 нм.

Аналогичная картина наблюдается и для агрегатов с другой фрактальной размерностью, при которой спектр исходно расщеплялся. Это объясняется следующим образом. Расщепление спектров агрегатов на линии происходит из-за наличия в них статистически доминирующих расстояний между частицами, на которых взаимодействие достаточно сильно, чтобы проявить себя в спектре. С ростом σ появляется всё большее число частиц разных размеров, что приводит к случайному изменению расстояний между ними и, как следствие, к изменению положения новых резонансных линий. В результате множество линий ЭПР сливаются в одну широкую линию.

Сказанное выше справедливо для агрегатов, в которых частицы разного размера расположены случайным образом друг относительно друга. Проведённое моделирование спектров и анализ упаковки частиц показали, что спектр ЭПР полидисперсных систем зависит от порядка расположения крупных и мелких частиц в агрегате, от того, какие (крупные или мелкие) частицы находятся в центральной части агрегата или на периферии. Так, из рис. 55 видно, что даже при достаточно большом значении σ , равном 0.9 нм, в спектре всё ещё присутствуют две линии ЭПР, когда самые маленькие частицы располагаются в центре агрегата, затем идут частицы большего размера, а самые большие находятся на периферии. (Заметим, что такой порядок распределения частиц, по-видимому, должен соответствовать строению реальных агрегатов, поскольку мелкие частицы обладают большей подвижностью и потому больше склонны к агрегации.)

Рисунок 55 - Спектры ЭПР фрактальных агрегатов (d_f = 2.2), состоящих из полидисперсных чачтиц (σ = 0.9), при случайном (1) и регулярном (2, 3) расположении частиц в агрегате. 2 – самые маленькие частицы расположены в центре, а самые большие – на периферии, 3 – самые большие частицы расположены в центре, а самые маленькие – на периферии.

При обратном порядке расположения частиц спектр состоит только из одной линии. Таким образом, случайный порядок расположения частиц является неким промежуточным вариантом, и расщепление спектра на две линии может наблюдаться даже для агрегатов, состоящих из полидисперсных частиц с довольно большим σ.

Было также прослежено изменение спектра ЭПР агрегата, растущего из полидисперсных частиц (рис. 56). Видно, что на начальной стадии агрегации поведение спектра такое же, как и в случае агрегата, состоящего из монодисперсных частиц. Но для агрегатов, состоящих из 25−100 полидисперсных частиц, наблюдаются заметные различия в характере изменения спектров агрегатов монодисперсных и полидисперсных частиц. Рис. 56 демонстрирует сильное влияние полидисперсности частиц на эволюцию спектра ЭПР.

Рисунок 56 - Спектры ЭПР фрактальных агрегатов, состоящих из 5 (1), 10 (2), 25 (3), 50 (4) 100 полидисперсных частиц (5). σ = 0.9 нм, d_f = 2.2.

Сравнение полученных нами экспериментальных спектров ЭПР суспензий наночастиц оксида железа с моделированными спектрами ЭПР агрегатов металлических наночастиц [62 - 64] показывает, что наиболее вероятно, экспериментальные спектры ЭПР обусловлены агрегатами полидисперсных наночастиц оксида железа, когда самые маленькие частицы располагаются в центре агрегата, затем идут частицы большего размера, а самые большие находятся на периферии.

Таким образом в результате проведенных нами экспериментальных исследований ЭПР суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в водных суспензиях можно сделать следующиевыводы:

1. Исследования ЭПР суперпарамагнитных суспензий наночастиц оксида железа в водных растворах и физиологических жидкостях показали наличие спектра ЭПР из двух линий, характерного для агрегатов наночастиц оксида железа, образующихся как в водных растворах, так и в растворах физиологических жидкостей. Вид и характеристики спектров ЭПР зависят от размеров и концентрации наночастиц, их дисперсного состояния, технологии приготовления.

2. Моделирование спектров ЭПР наночастиц и их сравнение с экспериментальными данными показывает наличие фрактальной структуры агрегатов наночастиц оксида железа. Зависимость спектров ЭПР фрактальных агрегатов полидисперсных наночастиц от ширины распределения частиц по размерам, а так же особенностей распределения разных частиц в агрегате показывает возможность использования метода ЭПР для оценки структуры, степени дисперсности наночастиц оксида железа в биологических жидкостях.

2. 4. Определение оптимальных параметров и условий улучшения контрастных свойств магнитно-резонансных изображений при использовании суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в молекулярной МРТ

Молекулярная МРТ основывается на том, что специальные молекулы – маркеры служат источником контраста на изображениях. Контраст в МРТ является результатом различия в сигнале от смежных пикселей или вокселей, сигнал в наибольшей степени зависит от трех основных параметров: протонной плотности, времени спин-решеточной релаксации T₁, и времени спин-спиновой релаксацииT₂. Плотность спинов, пропорциональная суммарной намагниченности спиновой системыM₀, отражает общее количество спинов, доступных для получения МР-изображения в пределах данной ткани (или пикселя).

Времена релаксации T₁иT₂описывают законы, по которым изменяется спиновая система.T₁- закон, по которому система возвращается к равновесию после возбуждения энергией РЧ поля. Чем быстрее система возвращается к равновесию, тем больше доступных спинов для возбуждения следующим импульсом.

Спин-спиновая T₂-релаксация описывает процесс расфазировки МР-сигнала из-за локальной неоднородности магнитного поля, возникающей за счет взаимодействия спинов друг с другом, в результате чего происходит потеря интенсивности МР-сигнала. В общем случае расфазировка спиновых прецессий ядерных моментов вызывается не только спин-спиновыми взаимодействиями, но и наличием неоднородных локальных внешних магнитных полей в объеме образца, обусловленных или неоднородностью постоянного магнитного поляB₀, или градиентными магнитными полями, создаваемыми соседними магнитными моментами других ядер и неспаренных электронов. В этом случае говорят о времени эффективной поперечной релаксации:

,

где γ – гиромагнитное отношение, δB – неоднородность локального магнитного поля.

Времена T₁иT₂зависят от нескольких параметров [53]: - резонансной частоты (индукции магнитного поля); - температуры; - подвижности спинов (микровязкости); присутствия больших молекул; - присутствия парамагнитных молекул.

Контраст МР-изображений зависит в большей или меньшей степени от T₁,T₂или и протонной плотности.

Так как T₁иT₂являются основными параметрами контраста МР-изображений, именно эти параметры должны быть изменены любым потенциальным контрастным агентом.

Связь спинов протонов с большими магнитными моментами суперпарамагнитных веществ увеличивает скорость релаксации воды, делая их полезными в качестве контрастных агентов для МРТ. В присутствии суперпарамагнитных веществ, таких как наночастицы оксида железа, времена релаксации ядерных спинов протонов воды, T₁, T₂и, сокращаются [54]. Что касается T₂и, магнитные наночастицы действуют как магнитные моменты, производящие крошечные градиенты локального магнитного поля, через которые протоны осуществляют диффузию. Так как каждый протон будет иметь отдельный путь через градиентное поле, то разности фаз между протонами будут накапливаться. В результате будет происходить индуцированная различной восприимчивостью расфазировка МР сигнала протона с последующим уменьшением. Это сокращениеможет быть использовано в МРТ-эксперименте, когда наночастицы сильно намагничены.

При использовании суперпарамагнитных частиц оксида железа релаксация вызвана время- или частотно-модулированными взаимодействиями между протонами и магнитными моментами частиц [55]. Связь может быть дипольного и скалярного характера, а временная или частотная модуляция возникает из-за трансляционной диффузии протонов, вращательной диффузии магнитных частиц и обмена между связанными протонами биомакромолекул и протонами свободной воды.

Есть много факторов, которые потенциально могут повлиять на способность магнитных наночастиц индуцировать уменьшение . К ним относятся физические размеры частицы и ее оболочки, химические свойства оболочки и окружающей среды, движение частиц и протонов, и неоднородности в самих частицах. Регулируя размер ядра, толщину оболочки, химию поверхности, и нацеленные на мишень лиганды, зонды наночастиц могут быть ориентированы, чтобы достигать конкретные мишени в виде определенных органов, клеток, или даже молекулярных маркеров различных заболеванийin vivo[56]. Релаксация магнитных наночастиц, как правило, модулируется размером ядра, часто в диапазоне 4-20 нм в диаметре. Однако, меньше известно о влиянии свойств оболочки на индуцированную наночастицами релаксацию. Поскольку многие из этих факторов могут взаимодействовать сложным образом, влияя на релаксацию, то выяснение влияния свойств оболочки на уменьшениеможет обеспечить полезную основу для разработки более мощных зондов-наночастиц без необходимости увеличения размера зонда.

Для сферической частицы определенного размера ядра, можно представить себе силовые линии магнитного поля, распределенными в пространстве в соответствии с уравнением для диполя [57]. Здесь мы касаемся только Z-компоненты магнитного поляB_z. Магнитные наночастицы вызывают релаксациюпротонов, проходящих через эти градиентные поля наночастиц. Протоны индивидуально накапливают изменения фазы в соответствии с, где Δt– промежуток времени, в течение которого протон находится в градиентном поле. Поскольку протоны находятся первоначально в фазе, то спад сигнала, из-за расфазировки, происходит из-за градиентного поля частицы, а не от основного магнитного поля. Ядро частицы производит определенное магнитное поле, через которое частицы могут диффундировать. Оболочка частицы, физически исключает диффузию протонов из некоторой области вокруг ядра. Хотя ядро производит то же поле, протоны имеют меньший доступ к более высоким градиентам вблизи частицы. Как результат, предполагается, что протонная релаксация в ситуации частицы с оболочкой будет медленнее, что приводит к наблюдаемому уменьшению скорости релаксацииR₂с ростом размера оболочки.

Цельюданного этапа проекта является определение оптимальных параметров и условий улучшения магнитно-резонансных изображений при использовании наночастиц оксида железа.

Объекты исследований: суперпарамагнитные наночастицы оксида железа в модельных водных растворах: в дистиллированной воде, в 2% геле «агар-агар» (смесь молекул воды и биомакромолекул полисахаридов агарозы и агаропекина), в водном растворе альбумина (50 г/л) (смеси воды и простых, растворимых в воде белков). В дальнейшем последние две смеси мы для упрощения иногда будем называть системой «биополимер-вода».

Магнитно-резонансные изображения изучались in vivo при введении наночастиц оксида железа в ткани мышей.

Приборные средства измерений:Фурье спектрометр ядерного магнитного резонанса СХР-300 (Брукер, Германия) с величиной магнитного поля 7,1 Тл. Все измерения осуществлялись в стандартных стеклянных ампулах диаметром 5 мм без вращения. Для стабилизации поля использовали сигнал дейтериевого резонанса тяжелой воды.

ЯМР релаксометр «Спин Трэк»с величиной магнитного поля 0.33 Тл. Резонансная частота на ядрах протонов - 14 МГц.

Микро ЯМР томограф AVANCEII- 500 (Брукер, Германия). Область исследования 30х30 мм, матрица 256х256 пикселей, толщина среза 1мм, расстояние между срезами 1,5 мм.

Параметры импульсных последовательностей для исследований in vitro

Для получения ¹Н ЯМР спектров использовалась одноимпульсная последовательность (длительность 90° импульса 0,5 мкс; длительность паузы между 90° импульсами 3 с; количество повторений 8).

Для измерения времени Т₁использовалась импульсная последовательность «инверсия-восстановление» 180--90(длительность 90° импульса 4,6 мкс; длительность 180° импульса 9,2 мкс; длительность пауз между 180° и 90° импульсами: от 1 мкс до 10с. 16 экспериментальных точек; длительность паузы между 180° импульсами 10 с).

Для измерения времени спин-спиновой релаксации Т₂применяли модифицированную импульсную последовательность Карра-Парселла (длительность 90° импульса 4,6 мкс; длительность 180° импульса 9,2 мкс; время эхо от 1 мкс до 7 мс для разных образцов; 512 сигналов эхо).

Скорость релаксации R2* вычислялась по ширине линии спектра (R2*=πΔυ_1/2), где Δυ_1/2– ширина спектральной линии на половине высоты. Измерения проводились только на частоте 300 МГц, использовалась одноимпульсная последователь (длительность 90° импульса 0.5 мкс, пауза между импульсами 3 с, количество накоплений от 4 до 32 в зависимости от уровня шумов).

Экспериментальные результаты

Измерения спектров ЯМР и времен магнитной релаксации суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в модельных водных растворах проводили в сравнении с водными растворами хлорного железа. Все спектры протонного резонанса имели вид одиночной линии ЯМР воды. Изменения вида спектров при варьировании дисперсий касались только формы линии, которая полностью характеризовалась единственным параметром ширины линии на половине высоты. Результаты измерений ширины линии представлены в графической форме в виде зависимости ширины линии протонов воды в суспензии от концентрации наночастиц. На рис. 20 показана типичная зависимость ширины линии ЯМР¹Н воды от концентрации наночастиц магнетита, покрытых декстраном и глицином, с размером частиц менее 100 нм. Наночастицы магнетита, покрытые глицином и декстраном, близким образом уширяют линии резонанса протонов воды.

Рисунок 20 – Зависимость ширины линии ЯМР ¹Н воды от концентрации наночастиц магнетита, покрытых декстраном и глицином

Поскольку ширина линии ЯМР протонов воды пропорциональна скорости релаксации, то оптимальным для определения параметров контрастирующих свойств МР изображений является изучение экспериментальных зависимостей скоростей релаксации протонов воды в зависимости от концентрации наночастиц в водном растворе.

Полученные экспериментальные значения скоростей релаксации R2*,R2,R1 протонов в различных средах при разных концентрациях суперпарамагнитных наночастиц оксида железа представлены в таблице 4 (для частоты ЯМР 300 Мгц) и таблице 5 (для частоты ЯМР 14 МГц).

Таблица 4 – Скорости релаксации, измеренные на частоте ЯМР 300 МГц в различных средах с разным содержанием наночастиц оксида железа

	2% гель “агар-агар” с наночастицами оксида железа			Вода дистиллированная с наночастицами оксида железа			Водный раствор альбумина 50 г/л с наночастицами оксида железа
C(Fe3+), мМ/л	R2*, 1/c	R2, 1/c	R1, 1/c	R2*, 1/c	R2, 1/c	R1, 1/c	R2*, 1/c	R2, 1/c	R1, 1/c
0.5	345±10	208±6	0.95±0.02	345±10	49±1	0.72±0.02	345±10	92±3	0.87±0.03
1	729±22	474±14	1.56±0.05	537±16	78±2	1.02±0.03	653±20	172±5	1,10±0.03
2	1341±40	870±26	2.5±0.1	691±21	126±4	1.69±0.05	1000±30	287±9	1,64±0.05
3	2148±64	1466±44	4.0±0.1	729±22	220±7	2.61±0.08	1303±40	459±14	2,47±0.07
5	3988±120	2564±77	6.9±0.2	1162±35	435±13	4.9±0.2	1815±54	788±24	4,2±0.1
8	5872±176	3636±109	9.7±0.3	1570±47	690±21	7,7±0.2	2490±75	1299±39	7,1±0.2
10	8356±250	5236±157	13.8±0.4	1840±55	841±25	10,8±0.3	3140±94	1613±48	8,9±0.3

Таблица 5 – Скорости релаксации, измеренные на частоте ЯМР 14 МГц в различных средах с разным содержанием наночастиц оксида железа

	2% гель агар-агар с наночастицами оксида железа		Вода дистиллированная с наночастицами оксида железа		Водный раствор альбумина 50 г/л с наночастицами оксида железа
C(Fe3+), мМ/л	R2, 1/c	R1, 1/c	R2, 1/c	R1, 1/c	R2, 1/c	R1, 1/c
0.5	184±6	17,5±0.5	8.3±0.2	0.76±0.02	99±3	12.7±0.4
1	385±12	39±1	15.4±0.5	2.83±0.08	166±5	18.7±0.6
2	700±21	66±2	78±2	7.9±0.2	284±7	42±1
3	1099±33	119±4	133±4	18.7±0.6	443±13	63±2
5	2000±60	200±6	222±7	41±1	746±22	100±3
8	2967±89	333±10	400±12	67±2	1247±37	172±5
10	4000±120	455±14	526±16	91±3	1605±48	213±6

По результатам измерений были построены графики зависимости скоростей продольнойR1 и поперечнойR2 ядерной магнитной релаксации протонов воды от концентрации суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в дистиллированной воде (рис. 21 и 22), в геле “агар-агар” (рис. 23 и 24), в растворе альбумина (рис. 25 и 26) для двух частот ЯМР: 300 и 14 МГц.

Рисунок 21 – Концентрационная зависимость скорости релаксации R1, полученная на частотах ЯМР 300 Мгц (поле B₀ = 7.1 Тл) и 14МГц (поле B₀ = 0.33 Тл) для образцов дистиллированной воды с различным содержанием наночастиц оксида железа

Рисунок 22 – Концентрационная зависимость скорости релаксации R2, полученная на частотах ЯМР 300 МГц (поле B₀ = 7.1 Тл) и 14 МГц (поле B₀ = 0.33 Тл) для образцов дистиллированной воды с различным содержанием наночастиц оксида железа

Рисунок 23 – Концентрационная зависимость скорости релаксации R1, полученная на частотах ЯМР 300 МГц (поле B₀ = 7.1 Тл) и 14МГц (поле B₀ = 0.33 Тл) для образцов геля “агар-агар” с различным содержанием наночастиц оксида железа

Рисунок 24 – Концентрационная зависимость скорости релаксации R2, полученная на частотах ЯМР 300 МГц (поле B₀ = 7.1 Тл) и 14 МГц (поле B₀ = 0.33 Тл) для образцов геля “агар-агар” с различным содержанием наночастиц оксида железа

Рисунок 25 – Концентрационная зависимость скорости релаксации R1, полученная на частотах ЯМР 300 МГц (поле B₀ = 7.1 Тл) и 14 МГц (поле B₀ = 0.33 Тл) для образцов водного раствора альбумина с различным содержанием наночастиц оксида железа

Рисунок 26 – Концентрационная зависимость скорости релаксации R2, полученная на частотах ЯМР 300 МГц (поле B₀ = 7.1 Тл) и 14 МГц (поле B₀ = 0.33 Тл) для образцов водного раствора альбумина с различным содержанием наночастиц оксида железа

По результатам измерений были также построены графики зависимостей скорости эффективной спин-спиновой (поперечной) R2* ядерной магнитной релаксации протонов воды от концентрации суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в дистиллированной воде (рис. 27), в геле “агар-агар” (рис. 28) и в растворе альбумина (рис. 29) для частоты ЯМР 300 МГц.

Как видно из рисунков 21–29 концентрационные зависимости соответствуют линейной зависимости общего вида R_i=r_i∙C+A, где С - концентрация магнитных наночастиц, выраженная в мМ, А - константа, определяемая скоростью релаксации протонов воды в отсутствие суперпарамагнитных наночастиц, коэффициент релаксационной эффективностиr_i. Анализ концентрационных зависимостей позволяет определить коэффициент релаксационной эффективностиr_iкак тангенс угла наклона экспериментальной зависимостиR_i=f (C) и вычислить этот коэффициент по соотношению:r_i= (1/C·Т_i) (мМ·с/л)^-1.

В результате проведенных исследований были определены релаксационные эффективности (релаксивности) r_i= (1/C·Т_i) (мМ·с/л)^-1 суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в дистиллированной воде, геле «агар-агар» и водном растворе альбумина (Таблица 6).

Рисунок 27 – Концентрационная зависимость скорости релаксации R2*, полученная на частоте ЯМР 300 МГц (поле B₀ = 7.1 Тл) для образцов дистиллированной воды с различным содержанием наночастиц оксида железа

Рисунок 28 – Концентрационная зависимость скорости релаксации R2*, полученная на частоте ЯМР 300 МГц (поле B₀ = 7.1 Тл) для образцов геля “агар-агар” с различным содержанием наночастиц оксида железа

Рисунок 29 – Концентрационная зависимость скорости релаксации R2*, полученная на частоте ЯМР 300 МГц (поле B₀ = 7.1 Тл) для образцов водного раствора альбумина с различным содержанием наночастиц оксида железа

Таблица 6 – Релаксационные эффективности наночастиц оксида железа в разных средах, измеренные на частотах 300 МГц и 14 МГц

Релаксационные эффективности наночастиц оксида железа	В 2% геле агар-агар	В дистиллированной воде	В водном растворе альбумина 50 г/л с	Частота, МГц
r2*, л/мМ*с	817±25	153±5	277±8	300
r2, л/мМ*с	508±15	87±3	162±5
r1, л/мМ*с	1.30±0.04	1.05±0.03	0.86±0.03
r2, л/мМ*с	395±12	54±2	159±5	14
r1, л/мМ*с	45±1	9.6±0.3	21.4±0.6

Анализ графиков на рис. 21–29 и данных таблицы 6 доказывает целесообразность использования коэффициента релаксационной эффективности r_iдля оценки контрастирующей эффективности суперпарамагнитных нанодисперсных частиц оксида железа в водных растворах и системах «биополимер – вода». Эксперименты показали, что чем больше значение коэффициента релаксационной эффективностиr_i, тем сильнее и лучше контрастирующая способность исследуемых контрастирующих агентов.

Нами разработана методика оптимального определения коэффициента релаксационной эффективности (r) при использовании суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в молекулярной МРТ.

В основу этой методики были положены измерения зависимости времен ядерной магнитной релаксации протонов воды от концентрации магнитных наночастиц в суспензии. Релаксационная эффективность магнитных наночастиц определяется как коэффициент r_1,2в эмпирической зависимости скоростей магнитной продольной (R1 = 1/Т₁) и поперечной (R2 = 1/Т₂) релаксации протонов молекул воды от концентрации магнитных наночастиц в исследуемых растворах

,

где С– концентрация магнитных наночастиц, выраженная в мМ/л,T₁,T₂– времена продольной и поперечной релаксации (с), соответственно,А– константа, определяемая скоростью релаксации протонов воды в отсутствие наночастиц.

Измерение времен продольной Т₁и поперечной релаксацииТ₂заключается в определении скорости возвращения спиновой системы протонов к равновесию в постоянном магнитном полеВ₀после воздействия на нее последовательности радиочастотных (РЧ) импульсов на частоте резонанса протонов воды.

Для измерения времени поперечной релаксации Т₂используется методика, основанная на последовательности импульсовCarr-Purcell-Meilboom-Gill. Для измерения времениТ₁используется двухимпульсная последовательность инверсии намагниченности 180--90.

Подготовка к измерению: в стандартные стеклянные ампулы диаметром 5 мм для записи ЯМР спектров вносятся по 500 мкл суспензий и добавляются по 50 мкл тяжелой воды («Изотоп») с тем, чтобы получить сигнал ЯМР дейтерия, необходимый для стабилизации магнитного поля. Концентрация железа в образце определяется переводом суспензии в раствор трехвалентного железа и последующим спектрофотометрическим тестированием тиоцианатного комплекса железа на УФ-спектрофотометре.

Процесс оценки контрастирующих свойств:

1. Образец помещается в датчик ЯМР спектрометра и включается ядерная стабилизация магнитного поля в соответствии с Руководством по работе на приборе.

2. Измерения проводятся при комнатной температуре без вращения образца с числом накоплений сигнала свободной индукции для достижения необходимого отношения сигнал/шум.

3. Времена релаксации измеряются, используя импульсные программы в программном обеспечении ЯМР-спектрометра.

4. Времена релаксации Т₁,Т₂определяются соответственно по нарастанию и спаду сигнала ядерной индукции протонов воды с помощью программы Origin по методу наименьших квадратов.

5. На основании экспериментальных данных для образцов с различной концентрацией магнитных наночастиц строят зависимость скорости релаксации R1 = 1/Т₁иR2 = 1/Т₂от концентрации магнитных наночастиц в исследуемых растворах.

3. Зависимость скорости релаксации R1 = 1/Т₁иR2 = 1/Т₂от концентрации наночастиц аппроксимируется линейной зависимостью по методу наименьших квадратов с использованием программExcelи Origin. Коэффициент релаксационной эффективности рассчитывается как тангенс угла наклона экспериментальной зависимостиR_i=f (C) по соотношению:r_i= (1/C·Т_i) (мМ·с/л)^-1.

Аналогичная методика используется и для определения релаксационной эффективности r2* = (1/C·Т₂^*). Единственное отличие заключается в том, что скорость релаксацииR2* = 1/Т₂^*вычисляется по ширине линии спектра ЯМР протонов исследуемых растворов (R2*=πΔυ_1/2), где Δυ_1/2– ширина спектральной линии на половине высоты.

Для определения условий улучшения контрастных свойств магнитно-резонансных изображений (МРИ) при использовании суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в молекулярной МРТ нами были проведены исследования по оптимизации импульсных РЧ последовательностей, используемых для снятия магнитно-резонансных томограмм.

Наночастицы оксида железа оказывают сильное влияние только на времена релаксаций T₂ и, наТ₁их влияние незначительное. Поэтому для оптимизации условий снятия МРИ в присутствии наночастиц оксида железа предлагается использование «быстрых» импульсных последовательностей [53], типа быстрое спин-эхо (RSE,RARE,FSE,TSE) и градиентное эхо (GRE,FLASH). Использование «быстрых» импульсных последовательностей сокращает время исследований, что позволяет избежать появления артефактов от движений пациентов без потери качества изображений.

Последовательности « быстрое спин-эхо»

Интенсивность сигнала в стандартной последовательности «спин-эхо»:

,

где K– константа, зависящая от кровотока, диффузии, перфузии и других параметров, ρ – протонная плотность,TE– время эхо,TR– время повторения. Диаграмма импульсной последовательности «спин-эхо» представлена на рисунке 30.

Рисунок 30 – Диаграмма импульсной последовательности «спин-эхо»

При нескольких сигналах эхо эта последовательность называется «мульти-эхо» последовательностью. Контраст МР-изображений здесь зависит в большей степени от T₂, особенно, при длительныхTRиTE.

На рисунке 31 представлены МР-изображения печени мыши, полученные с использованием импульсной последовательности «мульти-эхо» с параметрамиTE=10 мс,TR=2000 мс, 16 эхо.