2. 2. Исследования ямр спектральных и релаксационных характеристик суперпарамагнитных суспензий наночастиц в водных растворах и биологических жидкостях

Цель исследований:исследования концентрационных эффектов влияния суперпарамагнитных наночастиц оксида железа на форму линии ЯМР и времена релаксации Т1, Т2 протонов воды с учетом вкладов диффузионного обмена в неоднородное уширение линии ЯМР.

Объекты исследований: суперпарамагнитные наночастицы оксида железа в водных суспензиях, суперпарамагнитные наночастицы оксида железа в составе пористых микросфер целлюлозы.

Исследуемые параметры:ширина линии ЯМР протонов воды, химический сдвиг протонов воды и времена протонной релаксации Т₁, Т_2.

Методы определения: измерение спектров ЯМР методом ЯМР фурье-спектроскопии, измерение времени спин-решеточной релаксации Т₁ методом инверсии намагниченности, измерение времени спин-спиновой релаксации методом спинового эха.

Приборные средства измерений:Фурье спектрометр ядерного магнитного резонанса СХР-300 (Брукер, Германия) с величиной магнитного поля 7,1 Т. Все измерения осуществлялись в стандартных стеклянных ампулах диаметром 5 мм без вращения. Для стабилизации поля использовали сигнал дейтериевого резонанса тяжелой воды, которая добавлялась в количестве 50 мкл к 500 мкл суспензий магнитных наночастиц.

Параметры импульсных последовательностей

Для получения ¹Н ЯМР спектров использовалась одноимпульсная последовательность (длительность 90° импульса 0,5 мкс; длительность паузы между 90° импульсами 3 с; количество повторений 4).

Для измерения времени Т₁использовалась импульсная последовательность «инверсия-восстановление»180°-t-90°(длительность 90° импульса 4,4 мкс; длительность 180° импульса 8,8 мкс; длительность пауз между 180° и 90° импульсами: 1 мкс, 10 мкс, 100 мкс, 1 мс, 10 мс, 100 мс, 1с, 10 с, всего 8 точек; длительность паузы между 180° импульсами 10 с).

.Для измерения времени спин-спиновой релаксации Т₂применяли последовательность импульсовCarr-Purcell-Meilboom-Gill(длительность 90° импульса 4,4 мкс; длительность 180° импульса 8,8 мкс; время эхо от 1 мкс до 7 мс для разных образцов; 32 сигнала эхо).

Постановка задачи.

Избирательное введение в ткани органов пара, ферри и ферромагнитных веществ является одним из путей повышения информативности метода МРТ. МР-контрастные вещества вызывают усиление или ослабление сигнала ядерного магнитного резонанса, тем самым увеличивая контраст изображений органов. Мировой фармацевтический рынок диагностических МР-контрастных препаратов представлен двумя главными группами МР-позитивных и МР-негативных контрастных препаратов. МР-позитивные контрастные препараты вызывают повышение яркости мест локализации, что способствует улучшению видимости контура органа или мест патогенеза. Для избирательного контрастирования и визуализации канцерогенеза более предпочтительны ферро- и ферри- контрастные препараты негативного принципа действия, которые в отличие от экстрацеллюлярных комплексов гадолиния (позитивный контрастер) способны включаться в клетки по механизму эндоцитоза. Особый интерес представляют ферримагнетики оксида железа, которые способны образовывать наноразмерные частицы с суперпарамагнитными свойствами. Входя в состав МР-негативных контрастирующих препаратов, такие суперпарамагнитные наночастицы придают ему высокие значения магнитной восприимчивости. Среди МР – негативных контрастеров нанодисперсные препараты оксида железа занимают особое доминирующее положение. Для придания биосоместимости и повышения стабильности коллоидных суспензий частицы оксида железа покрывают гидрофильным слоем полимера или ионов органических молекул. В таком виде наночастицы оксидов железа сохраняют магнетизм, имеют малую токсичность и могут применяться в высоких дозах при диагностических обследованиях печени, селезенки, лимфатической системы и желудочно-кишечного тракта.

При неспецифическом поглощении наночастиц клетками ретикуло-эндотелиальной системы они индуцируют в ближайшей окрестности клетки сильное магнитное поле, которое визуализируется как затемнение визуального поля в методе МРТ. Уменьшение яркости зоны наблюдения связано с так называемым эффектом сокращения времени спин-спиновой релаксации Т₂ протонов молекул окружения, поэтому такие МР- препараты также называют Т₂– контрастерами. Эффективность контрастирующего действия суперпарамагнитных частиц зависит от степени экранирования магнитных центров при включении в макрофагальные клетки, моноциты, которое приводит с одной стороны к увеличению удельной намагниченности этих клеток за счет концентрирования магнитного материала, а с другой – к уменьшению содержания магнитных частиц во внеклеточной среде (плазме). Это приводит к сильному перераспределению магнитной плотности по тканям и как следствие к артефактным эффектам при исследованиях МРТ. Высокая интенсивность движения молекул воды возле магнитных наночастиц вызывает заметное ослабление измеряемого сигнала ЯМР в области вокселя анализируемой области, что в результате дает усиление контраста изображения. Необходимо ясно представлять роль экранирующего воздействия стенок клеток в трансмембранном транспорте воды на контрастирующие свойства препарата. Учет влияния диффузионного обмена имеет еще одно значение: нахождение магнитных наночастиц в ферментативно активной жидкой среде организма ведет к сокращению срока жизни магнитного состояния частицы. Включение магнитной частицы внутрь защитной оболочки увеличивает время жизни контрастера при парентеральном введении, но одновременно снижает фактор неоднородности магнитного поля за пределами зоны нахождения частицы в капсуле.

Для оценки фактора диффузионного обмена воды при включении магнитных наночастиц в клетки ретикуло-эндотелиальной системы рассмотрена модель микроносителя с внедренными магнитными наночастицами и регулирумой скоростью диффузионного обмена воды, которая отражает основные закономерности магнитной релаксации в биологических жидкостях. Исследование строилось путем сравнения скорости магнитной релаксации в суспензии суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в воде и суспензии микросферических носителей.

Содержание работы:

1. Синтез суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в гетерофазных условиях из растворов двух и трехвалентного железа по схеме Элмора-Массарта.

2. Включение суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в поры микросферической матрицы целлюлозы.

3. Измерение спектров ЯМР водных суспензий магнитных наночастиц оксида железа в воде и плазме крови.

4. Измерение скорости ядерной магнитной релаксации протонов воды в суспензиях магнитных наночастиц в воде и плазме крови.

Экспериментальные результаты исследований.

Полученные спектры ЯМР протонов дистиллированной воды и плазмы крови до- и после введения МР-контрастирующих веществ на основе наночастиц оксида железа (концентрация наночастиц Fe₃⁺составляла 1,8 мМ/л) (рис. 41) показывают, что сигналы ЯМР протонов воды и плазмы крови по форме до- и после введения контрастного вещества практически идентичны, наблюдается значительное уширение сигналов ЯМР как протонов воды, так и плазмы крови после введения контрастного вещества. До введения контрастера ширина линии составляла примерно 0,05 м.д., а после введения линия уширилась до 1 м.д.

Результаты измерений скорости ядерной магнитной релаксации протонов воды в суспензиях магнитных наночастиц в воде и плазме крови представлены в Таблице 5.

Рис. 41. Спектры ЯМР протонов дистиллированной воды (сверху) и протонов плазмы крови (снизу) до- (слева) и после (справа) введения МР-контрастирующих веществ на основе наночастиц оксида железа.

Таблица 5.Скорости ядерной магнитной релаксации протонов воды в суспензиях магнитных наночастиц в воде и плазме крови

Скорости ядерной магнитной релаксации	R2*, л/мМ с	R2, л/мМ с	R1, л/мМ с
Контрастный агент в воде	382±17	187±27	1,6±0,1
Контрастный агент в плазме крови	112±5	164±25	1,5± 0,1

По результатам измерений были получены зависимости скоростей ядерной магнитной релаксации протонов воды от концентрации контрастирующего вещества в суспензиях наночастиц оксида железа в воде и плазме крови (рис. 42-47).

Рис. 42. Зависимость скорости релаксации r₂^*протонов дистиллированной воды от концентрации наночастиц оксида железа.

Рис. 43. Зависимость скорости релаксации r₂протонов дистиллированной воды от концентрации наночастиц оксида железа.

Рис. 44. Зависимость скорости релаксации r₁протонов дистиллированной воды от концентрации наночастиц оксида железа.

Рис. 45. Зависимость скорости релаксации r₂^*протонов воды плазмы крови мышей от концентрации наночастиц оксида железа.

Рис. 46. Зависимость скорости релаксации r₂протонов воды плазмы крови мышей от концентрации наночастиц оксида железа.

Рис. 47. Зависимость скорости релаксации r₁протонов воды плазмы крови мышей от концентрации наночастиц оксида железа.

В результате исследования релаксационного поведения протонов воды в водных суспензиях магнитных наночастиц оксида железа и плазме крови установлено, что присутствие сывороточных белков в плазме уменьшает эффект неоднородного уширения линии ЯМР за счет экранирования ядра магнитных частиц адсорбционным слоем белков. Как видно из таблицы 5 этот эффект проявляется в трехкратном сокращении скорости ядерной магнитной релаксации R₂^*и практически не сказывается на скорости спин-решеточной релаксации. Образование адсорбционного слоя белков ведет к опсонизации частиц контрастера и усилению макрофагального захвата в процессе эндоцитоза, которое является вторым источником экранирования магнитных центров. Моделирование эффектов неоднородного уширения линии путем искусственного экранирования магнитных наночастиц оксида железа полупроницаемой матрицей целлюлозы подтвердило справедливость этих заключений.

Магнитные наночастицы оксида железа были введены в матрицу целлюлозы insitu. Получение микросферического пористого носителя суперпарамагнитных наночастиц осуществлялось следующим образом. В реактор ёмкостью 200 мл. помещали суспензию микросферической целлюлозыс с диаметром 80 -120 мкм.. При постоянном перемешивании и температуре насыщали поры микросфер смесью растворов солей железа в течение определённого времени. После пропитки капиллярных пор в реакционную массу добавляли раствор щелочи и выдерживали при постоянном перемешивании и температуре согласно условиям опыта. Наночастицы магнетита формировались внутри пор в соответствии с реакцией

2FeCl₃×6H₂O+FeSO₄×7H₂O+ 8NH₄OH→Fe₃O₄↓ + 6NH₄Cl+ (NH₄)₂SO₄ + 23H₂O

Fe²⁺+Fe³⁺+ 8OH^-↔Fe₃O₄↓ + 4H₂O

Композит микросферической целлюлозы, содержащий магнитные частицы, промывали деконтацией дистиллированной водой до нейтрального значения рН. В полученных образцах была измерена концентрация ионов железа. Измерение спектров ЯМР суспензий магнитных наночастиц, включенных в микросферический носитель целлюлозы(рис.48 и 49) показало значительное уширение линии резонанса внутренней воды.

Существование сложной капиллярной системы узких пор в микросфере препятствовало свободному диффузионному обмену внешней воды с внутренней, что отразилось в ее меньшей ширине линии внешней межчастичной воды. Уширение линии ЯМР, вызванное частицами магнетита 100 ррм, заметно превышает величину уширения, вызываемого парамагнитными ионами трехвалентного железа 17 ррм. и магнитными частицами в водных суспензиях. Положение центра линии резонанса протонов воды в суспензии в целом совпадает с положением линии резонанса объемной фазы воды 4,8 ррм..

Рис.48. Спектр протонного резонанса воды в суспензии суперпарамагнитных наночастиц оксида железа, осажденных в порах микросферической целлюлозы диаметром 80-120 мкм. Полуширина линии внутренней воды 100 ppm , внешней 0,67 ppm.

Рис.49. Спектр протонного резонанса 0,1М раствора FeCl_3,сорбированного микросферической пористой целлюлозой. Полуширина линии воды 17 ppm.

Анализ формы линии ЯМР суспензии микросфер (рис.50) показал, что форма линии лучше описывается функцией Лоренца, чем гауссовой функцией распределения.

Рис.50. Сравнительный анализ формы линии резонанса протонов сорбированной воды в суспензии микросферической целлюлозы. Фракция частиц диаметром 125-80 мкм в CCl₄.

Этот результат отличается от теоретических выводов по оценке неоднородного уширения линии в суспензии магнитных частиц в пренебрежении межчастичных магнитных взаимодействий [76, 77]. Искажение магнитного поля, индуцируемое полями магнитных наночастиц должно приводить к гауссовому типу распределения частоты резонанса. Диффузионный обмен воды в порах микросферического носителя сглаживает неоднородности поля за времена прецессии спинов (около нескольких мкс), что и приводит к изменению типа формы линии и моноэкспоненциальному спаду сигнала магнитной прецессии. Таким образом, включение суперпарамагнитных наночастиц в микросферический носитель сохраняет контрастирующие свойства магнитных наночастиц, одновременно защищая микрокристаллы магнетита от действия агрессивных факторов биологических жидкостей внутренней среды организма. Сокращение времени спин-спиновой релаксации суспензии магнитных носителей, оцененное по ширине линии, не уступает величине скорости релаксации суспензии суперпарамагнитных наночастиц непосредственно в водном растворе. Следовательно, контрастирующие свойства суспензии суперпарамагнитных наночастиц, включенных в состав микросфер целлюлозы, сохраняются на уровне первоначального источника - суспензии наночастиц оксида железа в воде. Моделирование макрофагальных клеток микросферами с ограниченным диффузионным транспортом воды через поверхность сфер показало, что контрастирующие свойства магнитных наночастиц не должны утрачиваться при макрофагальном эндоцитозе магнитных наночастиц.

Выводы:

1. Показано, что контрастирующая эффективность магнитных наночастиц при включении в микросферический носитель из целлюлозы не утрачивается по сравнении cсуспензией магнитных наночастиц непосредственно в водной среде.

2. Ограниченный диффузионный обмен между капиллярной внутренней водой и внешней объемной фазой способствует сокращению времени спин-спиновой релаксации, и тем самым уширению линии ЯМР, что является ведущей причиной контрастирующей эффективности магнитных наночастиц магнетита.

3. Релаксационная эффективность магнитных наночастиц оксида железа в плазме крови падает из-за экранирующего воздействии адсорбционного слоя сывороточных белков вокруг частиц.