Работа 104. Определение активности алкогольдегидрогеназы в сыворотке крови по Шкурски и др. С дополнениями и.В.Бокия, м.С.Усатенко и в.Ф.Трюфанова

Реактивы. Пирофосфатный буфер, 0,1 М раствор, рН 8,5^*; n-нитрозодиметиланилин, 26 мкМ раствор^*; н-бутанол, 0,25 М водный раствор; НАД⁺, свежеприготовленный раствор (3,3 мг НАД в 1 мл 0,25 М раствора бутанола).

Оборудование. Пипетки на 0,1; 1 и 2 мл; стеклянные палочки; секундомер; спектрофотометр.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на способности алкогольдегидрогеназы (АДГ) катализировать две последовательные реакции: НАД-зависимое окисление бутанола и восстановление n-нитрозодиметиланилина с участием НАД∙Н₂, образовавшимся в ходе первой реакции. При этом n-нитрозодиметиланилин, имеющий в растворе интенсивно желтую окраску, обесцвечивается. Об активности АДГ судят по скорости светопоглощения красителя, которое регистрируют на спектрофотометре при 440 нм.

Ход определения. Спектрофотометр подготавливают к работе, устанавливают рабочую длину волны на 440 нм и стрелку шкалы отсчета с помощью рукоятки на «нуль» при закрытой шторке.

В кювету спектрофотометра помещают 2 мл раствора n-нитрозодиметиланилина и 0,5 мл сыворотки крови. Против этой кюветы рукояткой «щель» устанавливают шкалу отсчета на 0,300, после чего реакцию запускают добавлением в кювету 0,1 мл раствора НАД в растворе бутанола. Смесь быстро перемешивают стеклянной палочкой. Регистрируют снижение экстинкции инкубационной среды в течение 2 мин при 25˚С.

Примечание. Определение активности АДГ в каждом образце сыворотки проводят дважды, а при расхождении результатов измерения более чем на 10% - три раза. После этого вычисляют среднее значение изменения экстинкции за 1 мин.

Расчет производится по формуле

х = 320,5∆Е ,

где х – активность АДГ, мкмоль/(мин∙л);

320,5 – коэффициент расчета активности, выраженный в мкмолях превращенного субстрата при указанных условиях инкубации;

∆Е – изменение экстинкции при 440 нм за 1 мин.

Если изменение экстинкции при 440 нм превышает 0,050 за 1 мин, то сыворотку крови следует развести натрий-фосфатным буфером в 2-4 раза. Измеренную величину активности умножить на фактор разведения.

Для определения активности АДГ рекомендуется брать свежеполученную сыворотку крови. При хранении активность фермента снижается, поэтому значение активности, измеренной после хранения, следует умножить на соответствующий коэффициент, установленный эмпирически:

Время хранения сыворотки, сут.	0	1	2	3	4	5	6	7
Коэффициент:
при 4˚С	1,00	1,03	1,04	1,09	1,11	1,12	1,15	1,17
при 20˚С	1,00	1,18	1,20	1,43	1,47	1,54	1,66	2,38

Оформление работы. Сравнить полученное значение активности АДГ с нормой и сделать соответствующие выводы.

Практическое значение работы. Алкогольдегидрогеназа не проявляет абсолютной субстратной специфичности. Этот фермент катализирует окисление, помимо этанола, ряда первичных и вторичных спиртов, этиленгликоля и т.д., причем в некоторых случаях с большей скоростью, чем этанола. АДГ содержится в гиалоплазме клеток многих органов и тканей, но в ткани печени ее активность в 20-40 раз выше, чем в других. В сыворотке крови концентрация фермента у здоровых людей очень низка и традиционными методами практически не выявляется. Описанный метод позволяет определить активность АДГ. У здоровых людей активность АДГ в сыворотке крови регистрируется в пределах 0,32-2,56, а в среднем 1,18 мкмоль/мин∙л. У лиц, злоупотребляющих алкоголем, активность фермента в сыворотке крови повышается в зависимости от длительности приема алкоголя и стадии алкоголизма. Тест на алкогольдегидрогеназу сыворотки крови используется в диагностике алкоголизма и контроля эффективности лечения этого заболевания.

Низкая активность АДГ при поражениях печени, в которой окисляется до 90% поступающего в организм этанола и других спиртов, или генетическая недостаточность этого фермента снижает обезвреживание алкоголя и усугубляет его отрицательное действие на функции систем организма.