Работа 21. Обнаружение холинэстеразы

(ацетилхолинацилгидролаза; КФ 3.1.1.7)

В сыворотке крови экспресс-методом Херцфельда и Штумпфа

Реактивы. Полоски фильтровальной бумаги, смоченные субстратно-индикаторным раствором (0,2 г ацетилхолина-бромида и 0,1 г дибромсульфофталеина растворить в 7 мл 96%-ного этанола).

Оборудование. Предметные стекла; пинцеты; микропипетки; часы; водяная баня.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на изменении окраски индикатора дибромсульфофталеина (от синей до зеленой и желтой), происходящем в результате освобождения уксусной кислоты при гидролизе ацетилхолина холинэстеразой:

O

║ холинэстераза

(CH₃)₃N⁺―CH₂―CH₂―O―C―CH₃ + H₂O (CH₃)₃N⁺―CH₂―CH₂OH + CH₃COOH

ацетилхолин холин уксусная

кислота

Ход определения. На чистое предметное стекло наносят каплю сыворотки крови, на нее пинцетом опускают полоску бумаги, которая тут же окрашивается в синий цвет. Засекают время. Пробу накрывают вторым предметным стеклом и отмечают время появления желтого окрашивания бумаги.

Оформление работы. Занести результаты (время появления желтого окрашивания индикаторной бумаги от момента помещения ее на каплю сыворотки крови) и сравнить их с нормой, которая колеблется от 5 до 20 мин. Сделать вывод о присутствии изучаемой гидролазы в сыворотке крови.

Работа 22. Определение активности фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы в сыворотке крови по методу в.И.Товарницкого и е.Н.Волуйской

Реактивы. Фруктозо-1,6-бисфосфата, натриевая соль, 1%-ный раствор^*; смесь на альдолазу^*, раствор 2,4-динитрофенилгидразина 0,1%-ный раствор, трихлоруксусная кислота 10%-ный раствор, едкий натрий 3%-ный раствор, калибр. раствор^*.

Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки на 0,2; 0,1; 1,0; 2,0; 5,0 мл; центрифуга; термостатирующая водяная баня; фотоэлектроколориметр.

Материал. Исследуемая сыворотка крови.

Метод основан на определении дигидроксиацетонфосфата (ДОФ), образующегося в ходе расщепления фруктозобисфосфата с участием альдолазы:

Дигидроксиацетонфосфат при взаимодействии с 2,4-динитрофенил­гидразином образует гидразон, который в щелочной среде имеет коричнево-бурую окраску:

Ход определения. В центрифужную пробирку (опытная проба) к 0,2 мл смеси на альдолазу с фруктозо-1,6-бисфосфатом (смешать 1,75 мл смеси на альдолазу с 0,25 мл фруктозо-1,6-бисфосфата) внести 0,1 мл сыворотки крови. В другую центрифужную пробирку (контрольная проба) взять 0,175 мл смеси на альдолазу без фруктозо-1,6-бисфосфата и добавить 0,1 мл сыворотки крови. Обе пробирки поместить в термостат при температуре 37˚С на 1 час. По истечении времени пробирки вынуть из термостата и добавить к контрольной пробе 0,025 мл раствора фруктозо-1,6-бисфосфата. Для осаждения белков в обе пробирки внести по 0,3 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Центрифугировать 10 минут при 3000об/мин, слить центрифугат в другую пробирку и, добавив по 0,6 мл 3% раствора едкого натрия, оставить стоять на 10 минут при комнатной температуре. Затем прилить по 0,6 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина и пробы поместить на 10 минут в термостат или водяную баню при температуре 37˚С, затем добавить 4,2 мл 3% раствора едкого натрия. Фотометрировать на ФЭКе при длине волны 530-540 нм (зеленый светофильтр) в кювете на 0,5 см против контрольной пробы.

Примечание. Так как окраска неустойчива, то фотометрировать следует сразу после добавления едкого натрия.

Расчет. По полученной величине экстинкции по калибровочному графику находят активность фермента в мкмоль/ч∙л.