53. Непрерывное проточное культивирование.

Ответ. Метод проточного непрямого культивирования пришел в микробиологию из химической технологии. Непрерывные процессы имеют значительные преимущества перед периодическими: возможность специализации аппаратуры для каждой стадии непрерывного процесса, стабилизации его во времени, улучшение качества продукции, легкость регулировки и, главное, возможность автоматизации. Этими преимуществами объясняется тенденция в биотехнологии к переходу от периодических процессов к непрерывным. Принцип непрерывного (проточного) культивирования микробов состоит в том, что в сосуд, где размножаются микроорганизмы, непрерывно подается свежая питательная среда и одновременно втекает такой же объем культуры. По такому принципу организуются две разновидности технического процесса непрерывного культивирования: процесс (технология) полного вытеснения и технология полного смещения. При технологии полного вытеснения сосуд для выращивания микроорганизмов (трубчатый ферментер) представляет собой трубку, расположенную горизонтально или вертикально, в которую втекают среда и посевной материал и вытекает культура. Перемешивание не производится. Таким способом сравнительно легко и несложно культивировать микроорганизмы, не требующие аэрации. С одной стороны ферментера подаются среда и посевной материал, где микробная популяция находится в начале своего развития. По ходу трубки культура «стареет», субстрат исчерпывается, накапливаются продукты метаболизма и вытекающая культура приходит в состояние аналогичное стационарной фазе роста периодической культуры. В результате такого процесса в ферментере воспроизводится полная кривая роста, но не во времени, а в пространстве. В настоящее время появились ферментативные аппараты, обеспечивающие процессы с режимом, приближающимся к полному вытеснению и при аэробном культивировании. Процесс полного вытеснения применяется в промышленности в тех случаях, когда желательно избежать потери времени на опорожнение, стерилизацию и заполнение емкости. Его применяют в пищевой промышленности, когда используются сложные среды и стоит задача наиболее экономично провести процесс аналогичный тому, который ведется в периодическом режиме. Пример практического применения рубчатого ферментера – анаэробная стадия при производстве пива в бешенных проточных емкостях. В этих случаях не требуется аэрации и процесс идет без перемешивания. Если этот процесс аэробный, то его ведут в батарее аэрируемых ферментеров. При этом кривая роста периодической культуры распределяется по ходу батарее. В процессе полного смешивания рост культур происходит в емкости – ферментере при интенсивном перемешивании. Перемешивание достигается продуванием воздуха или работой мешалки (или тем и другим одновременно). Во всей массе культуры условия должны быть совершенно одинаковыми. В ферментере создаются условия соответствующие одной точки кривой роста культуры. При больших потоках среды эти условия близки к фазе логарифмического роста, при малых – приближаются к условиям стационарной фазы роста культур. При таком методе может быть воспроизведена любая точка роста периодической культуры. В установившемся режиме скорость потока среды, отнесенная к объему культуры в ферментере, называют коэффициентом разбавления. Коэффициент разбавления равняется удельной скорости роста µ. D = = µ, где: D – коэффициент добавления, F – скорость потока среды, V – объем культуры в ферментере, µ- удельная скорость роста. Это означает, что культура находится в устойчивом стационарном состоянии, в результате концентрация биомассы (Х) в ферментере остается постоянной. В таком случае скорость роста определяется коэффициентом разбавления. Она уравнивается с ним и концентрация субстрата (S) также остается постоянной (равномерно расходуемый субстрат обновляется с равномерной скоростью притока новой питательной среды). При таком способе культивирования культура (вследствие возникновения феномена синхронизации роста) обладает способностью самостоятельно автоматически подстраиваться к измененным условиям процесса. Если условия изменяются в сторону ускорения роста, то в ферментере повышается концентрация биомассы и понижается концентрация субстрата, при замедлении роста – концентрация биомассы понизится, а концентрация питающего субстрата повысится. При кратковременном изменении условий культивирования эти состояния микробной популяции обратимы и на изменение скорости потока культура реагирует соответствующим изменением концентрации биомассы и концентрации субстрата, не выходя из стационарного состояния. Однако, следует помнить, что чрезмерное увеличение скорости потока, причины сильно замедляющие рост, могут привести к тому, сто скорость роста (µ) окажется меньше коэффициента разбавления (F). И в таком случае культура вымоется из ферментера. Воспроизведение в потоке определенной точки кривой роста культур широко применяется в промышленности при наращивании биомассы микроорганизмов. Хорошо отработанный периодический процесс выращивания экономически выгодно воспроизводить в проточном варианте, поскольку культура непрерывно находится в состоянии максимальной активности нужного процесса, не тратится время на освобождение емкостей и лаг-фазу. При наращивании биомассы в проточных условиях биотехнологический процесс стремятся вести при возможно большей скорости потока, но не настолько большой, чтобы в среде оставался недоиспользованный субстрат. Таким образом получают наибольший экономический коэффициент, который при непрерывном культивировании определяют следующим образом: D = = , где: S0 – концентрация питательного вещества в поступающей среде, S – концентрация питательного вещества в культуре, вытекающей из ферментера, Х – концентрация биомассы в вытекающей культуре. Существует много способов непрерывного культивирования микроорганизмов, но в биопромышленности в основном применяются два типа. Хемостатный, при котором состояние равновесия или стационарное состояние достигается путем регулирования поступления лимитирующих рост субстратов; Турбидостатный, при котором состояние равновесия или стационарное состояние культуры достигается путем удаления биомассы и замещения её свежей средой со скоростью равной скорости роста культуры. Хемостат в отличии от турбидостата позволяет с высокой скоростью регулировать условия лимитирования роста (субстратное лимитирование), тогда как турбидостат предпочтительнее для изучения микроорганизмов в условиях близких к максимальной удельной скорости роста. Хемостатное культивирование основано на том, что в простейшей форме рост бактерий можно предоставить как совокупность реакций, в которых скорость роста культуры определяется самой медленной реакцией метаболизма. Хотя в растущей культуре осуществляется метаболизм многих питательных веществ, скорость роста культуры в любой момент времени определяется скоростью метаболизма лишь одного питательного субстрата. Тот субстрат, или тот компонент питательной среды, метаболизм которого осуществляется медленнее всего и который таким образом определяет скорость роста бактериальной культуры, принято называть лимитирующим фактором. Хемостатный метод культивирования незаменим в лабораторных исследованиях физиологии микроорганизмов и клеток тканей. В промышленности он применяется при наращивании микробной биомассы, если известно, какой именно фактор ограничивает рост. Турбидостат представляет собой самую простую из всех хорошо перемешиваемых систем непрерывного перемешиваемых систем непрерывного культивирования. Концентрация клеток при турбидостатном культивировании регулируется постоянной подстройкой скорости поступления питательных компонентов. В отличии от хемостата концентрацию биомассы в турбидостате выбирает оператор, а скорость разбавления и соответственно концентрация субстратов поддерживается таким образом, чтобы сохранялся заданный уровень биомассы. Турбидостатное культивирование осуществляют обычно в тех случаях, когда лимитирующий фактор не известен или в лимитирующих количествах субстрата нет необходимости. Поэтому субстрат добавляется в ферментер в избытке. Избыток концентрации всех компонентов питательной среды делает работу турбидостата стабильной даже при удельной скорости роста культуры близкой к максимальной. Турбидостат позволяет регулировать систему в широких инервалах концентраций биомассы при скорости разбавления близкой к критической. Именно в этих условиях химостат менее стабилен. В свою очередь, постоянство концентрации микробной биомассы удерживают регуляцией скорости потока, которую осуществляет не оператор, а автоматическая система. В большинстве случаев с этой целью прибегают к прямому оптическому измерению мутности биомассы, котороя зависит от концентрации клеток. Для этого ферментер оборудуют фотоэлектроколлориметром или аналогичным ему устройством, работающем по принципу светорассеявания. Если концентрация клеток остается на нужном уровне питательная среда подается с заданной скоростью, а при снижении концентрации клеток подача питательной среды прекращается. Именно этот принцип работы турбидостата обеспечивает его устойчивую работу даже при коэффициенте разбавления близком к критическому – на границе вымывания клеток. Сигналом для подачи среды может быть не только оптическая плотность (мутность), но и любой параметр среды, поддающийся измерению электродом или другим устройством, переводящим величину измерительного параметра в величину электрического потенциала. Последний усиливается и приводит в действие работу насоса, подающего раствор или питательную среду. Поскольку основные метаболические функции (поглощение бактериями кислорода, выделение CO2, изменение рН), тесно связанны со скоростью роста клеток и в конечном счете с удельной скоростью роста культуры, именно эти показатели чаще других используют как измеряемые переменные при регулировке потока среды. Например, для процессов культивирования имеющих прямую связь между приростом биомассы и изменением значения рН среды, используется рН-статный способ управления скоростью потока среды. Скорость потока с помощью автоматических устройств уравнивается со скоростью изменения рН растущей популяции, а следовательно, и со скоростью роста культур. Это обеспечивает поддержание рН на заданном уровне, а скорость роста является максимальной в данных условиях. Изменяя условия, можно проследить за соответствующими изменениями максимальной скорости роста культур. В последнее время в эксплуатацию вводятся сложные комплексы ферментер-ЭВМ, обеспечивающие более высокий уровень использования турбидостатного способа непрерывного культивирования. Как химостатное, так и турбидостатное культивирование имеют большое количество вариантов. Например, тот и другой способы могут осуществляться одностадийно и двустадийно. Одностадийное культивирование означает, что процесс ведется в одной емкости (в одном ферментере), а двухстадийное – в двух последовательных ферментерах. Одностадийное химостатное культивирование применяется при необходимости воспроизвести любую скорость роста культур, кроме максимальной. Двухстадийное культивирование в двух последовательных ферментерах позволяет обеспечивать культуры максимальной скоростью роста и даже создать условия для ее превышения. Для этого в первом ферментере ведется культивирвание при D< µмах , а во второй подается культура из первого и добавляется свежая питательная среда. При этом во втором ферментере происходит повышение скорости протока вплоть до превышения µмах, а вымывание не происходит, т.к. из первого ферментера непрерывно поступает культура. Одностадийное турбидостатное культивирование используют для получения максимальной скорости роста. При двухстадийном культивировании можно воспроизвести во втором ферменте вторую фазу роста периодической культуры – вернее фазу роста, связанную с синтезом вторичного продукта метаболизма. В первом ферментере ведется выращивание культуры при большой скорости роста, что соответствует фазе логарифмического роста периодической культуры. Второй ферментер берется большего размера или с содержанием значительно большего количества питательной среды. Поэтому поступающая из первого ферментера культура оказывается в условиях замедленного роста, соответствующего скорости роста периодической культуры в фазу стационарного максимума. Именно эта скорость и является оптимальной для синтеза вторичного продукта. При низких концентрациях субстрата и при низкой концентрации клеток можно возвратить в ферментер часть вытекающей из него биомассы, возврат повышает концентрацию и ускоряет процесс. Вариантов возврата биомассы может быть несколько. Сепарируют вытекающую культуру и сгущенную часть возвращают в ферментер. Устанавливают различные фильтрующие устройства, позволяющие вытекать культуральной жидкости, но задерживающие клетки.