Тема 3 структура и функции гена

3.1 Рекомбинационный анализ гена

Рекомбинационный анализ – метод исследования структурно-функциональной организации генетического материала по результатам рекомбинации наследственных признаков, хромосом, генов, аллелей; основной метод генетического, в частности гибридологического, анализа. Цель Рекомбинационный анализзаключается в определении локализации генов, ответственных за проявление исследуемых признаков, а в некрых случаях в определении их тонкого строения. В генетике рекомбинационный анализ является одним из основных методов, дающих возможность выяснить организацию генома того или иного биол. вида. Рекомбинационный анализ позволяет устанавливать идентичность, сопряженность или независимость друг от друга механизмов генетического контроля важных признаков и свойств организмов, что является основой для рационального прогнозирования возникновения таких признаков и свойств и их проявления у потомков. В мед. генетике это необходимо для расчета вероятности возникновения (передачи) наследственного заболевания и, соответственно, для его профилактики. В селекции животных, растений и микроорганизмов рекомбинационный анализ нужен для целенаправленного создания генотипов, обеспечивающих появление организмов с требуемыми сочетаниями признаков и свойств.

Основным принципом рекомбинационного анализа является полный количественный учет в потомстве гибридов всех сочетаний анализируемого (тестируемого) признака с другими (или другим) наследственными признаками, правила наследования которых известны и которые используются в качестве генетических маркеров. В генетике эукариотов основным условием для проведения рекомбинационного анализа является использование организмов генетически маркированных константных линий (обычно инбредных). В качестве генетических маркеров могут быть использованы морфологические, физиологические или биохимические признаки, контролируемые генами с установленной локализацией и стабильным проявлением, т. е. генами с полной пенетрантностью и неварьирующей экспрессивностью не только в исходных линиях, но и у гибридов и в их потомстве. Наличие в кариотипе эукариотов более одной пары хромосом требует использования в рекомбинационном анализе множественно маркированных линий, у которых каждая из пар хромосом (групп сцепления) несет хотя бы один генетический маркер. У малохромосомных видов иногда удается обойтись одной комбинированной линией. У многохромосомных видов невозможность одновременного учета у одной особи большого числа признаков обычно вызывает необходимость создания набора линий-тестеров.

В генетике прокариотов (бактерий, вирусов) Рекомбинационный анализтакже основывается на получении рекомбинантов по исследуемым и маркерным признакам, однако гаплоидность этих организмов и отсутствие у них гетерозиготности требуют применения специфических методов получения и оценки рекомбинантов, отличных от обычной гибридизации у бисексуальных диплоидных эукариотов.

Первым этапом рекомбинационного анализа у эукариотов является установление принадлежности гена, контролирующего изучаемый признак, к одной из групп сцепления генов, т. е. к определенной хромосоме. Традиционно это делается путем скрещивания (или серии скрещиваний) представителей испытуемой формы организмов с особями линий-тестеров для выявления тех генетических маркеров, в сочетаниях с которыми нарушается правило независимого комбинирования признаков. В генетике человека такое исследование представляет собой планомерный поиск пробандов с заданными сочетаниями наследственных признаков и последующее генеалогическое изучение наследования этих сочетаний в семьях пробандов. С разработкой методов отдаленной гибридизации соматических клеток в культуре и изучения их биохим. фенотипа появилась возможность определять принадлежность того или иного гена к определенной хромосоме по корреляции между сохранением данной хромосомы в кариотипе гибрида и проявлением эффектов исследуемого гена в соответствующих клетках (или, наоборот, по корреляции исчезновения данной хромосомы из кариотипа гибрида с исчезновением эффекта исследуемого гена).

Вторым и основным этапом рекомбинационного анализа является определение положения (локализации) гена на соответствующей хромосоме. Обычно оценивают частоты рекомбинации исследуемого гена с двумя генетическими маркерами, далеко отстоящими друг от друга на данной хромосоме. Результаты такого анализа выражают в процентах кроссоверных гамет (так наз. морганиды, единицы карты). Накопление и обобщение данных по рекомбинационным расстояниям позволяет строить генетические карты хромосом. В генетике человека определение рекомбинационных расстояний по генеалогическим данным ограничивается редкой встречаемостью семей, в которых наследуются изучаемые сочетания сцепленных признаков. Поэтому основной вклад в точное картирование генов человека дают методы генетики соматических клеток. Особенно эффективно при этом делеционное картирование: если в кариотипе присутствует обычная хромосома, несущая исследуемый ген, а ее гомолог содержит делецию той же локализации, что и этот ген, то фенотип особи и наследование анализируемого признака будут следовать закономерностям, установленным для гемизиготного состояния генов. Составление генетических карт путем делеционного картирования требует использования многих клеточных линий с делениями по самым разным участкам разных хромосом генома. Клеточные линии обычно получают от пациентов с хромосомными болезнями, обусловленными хромосомными делециями. Так как людей с такими болезнями немного, широкое применение картирования генов с помощью делеций невозможно. Кроме того, таким методом можно картировать только те гены, для которых известны их проявления на клеточном уровне.

В генетике человека возможности рекомбинационного анализа ограничиваются пока установлением локализации генов в пределах кариологически (с помощью методов дифференциальной окраски) идентифицируемых сегментов хромосом, содержащих по несколько десятков генов. Возможности рекомбинационного анализа в экспериментальной генетике значительно шире: исследование потомства соответствующих гибридов при анализировании нескольких тысяч особей позволяет картировать положение генов с точностью до сотых долей морганиды, что примерно соответствует отдельным генетическим локусам. Если же увеличить число исследуемых особей в соответствующих типах скрещиваний до нескольких десятков тысяч, то, кроме продуктов кроссинговера, можно обнаружить и продукты значительно более редкой внутригенной рекомбинации, позволяющей исследовать тонкую структуру отдельных генетических локусов. Имеются отдельные примеры такого тонкого рекомбинационного анализа для эукариотов (дрозофилы, нейроспоры, дрожжей), но особенно большие успехи достигнуты в изучении с помощью рекомбинационного анализа внутренней организации генов у бактерий, вирусов и бактериофагов.