Volkova EM Kaspirovich DA Genetika s osnovami biometrii EUMK

Генетика с основами биометрии

особенно с развитием генетики микроорганизмов. Стало ясно, что «псевдоаллелизм» – правило, а не исключение.

5. Цис-транс-тест на аллелизм

Исходя из того, что ген представляет собой сложную в функциональном и рекомбинационном отношениях единицу наследственности, для определения аллельности мутаций у дрозофилы Льюис предложил тест на комплементарность, так называемый цис-транс-тест.

Согласно этому тесту мутации попарно испытывают в гетерозиготе в

двух конфигурациях: цис – обе мутации в гибриде происходят от одного родителяÏолесÃÓ, и транс – они поступают в гибрид от разных родителей.

Сущность его сводится к тому, что при цис-положении обе мутации гибрид получает от одного родителя, при транс-положении – от обоих. Наиболее существенную роль играет транс-тест, а цис-тест является как бы его контролем. Транс-тест по сути аналогичен функциональному тесту на аллелизм, предложенному Морганом. Принципиальные же различия между

ними состоят в том, что Морган читал ген неделимой структурной единицей

хромосомы, а Льюис исходил из того, что ген представляет собой сложную

систему, состоящую из нескольких амо тоятельных в фенотипическом выражении функциональных диниц. Цис-транс-тест, таким образом,

позволяет установить, алл льны или н алл льны мутации даже в том случае, если они локализуются в одном г не, но принадлежат разным функциональным единицам.

В цис-типе наб юда тся по ное доминирование нормальных аллелей и оба рециссивных мутантных а е я не проявляются. В другом генетическом изомере, названн м транс-типом, мутантные псевдоаллели находятся в

разных хром с мах (а+/+b).

В эт м случае бнаруживается псевдоаллелизм и рецессивные признаки

проявляются.

Грин изучил 19 независимых мутаций, давших развитие признака

lozenge. Они оказались связанными изменениями в трех рядом

расположенных локусах. Между этими локусами с ничтожной частотой происходил перекрест (0,09 и 0,06%). Взаиморасположение этих локусов, каждый из которых имеет свою серию аллелей, имеет вид:

Генетика с основами биометрии

Путем перекреста были получены хромосомы с разным взаимоположением мутантных аллелей трех локусов. Цис-типы во всех случаях обнаруживали нормальные признаки, а транс-типы – проявление рецессивов:

причинойÏолесÃÓпоявления вещества А за счет реакции, которая преобразует какойто исходный субстрат (С) в это вещество (реакция С→А). Второй

У всех транс-типов, при которых п евдоаллели расположены в разных хромосомах, развивается ф нотип р ц ивных мутантов. С другой стороны,

для всех цис-типов, при которых мутантные п евдоаллели расположены в

одной хромосоме, характ рна полная р цессивность мутаций, у них развивается норма ьный ф нотип.

Исходя из представ ния о связанности функций псевдоаллелей, было

предложено объяснить это загадочное влияние положения аллелей в разных генетических из мерах изменением цепи последовательных биохимических

Илфайном. Люис также высказал, а затем детально разработал эти гипотезы.

В осн ву эт го п жена идея о том, что последовательность

нормальных аллелей данной группы в хромосоме не имеет случайного

характера, она отражает последовательность прохождения ряда

биохимических реакций, в которых отдельный локус хромосомы определяет

одно звено. Если мы имеем два псевдоаллеля (a+b+), то протекание цепи

реакций будет иметь такой вид: действие первого псевдоаллеля (а+) служит

псевдоаллель (b+) преобразует вещество А в вещество В (реакция А→В). В случае наличия большого числа рядом расположенных псевдоаллелей реакция приведет к появлению веществ D, Е и т.д. Условием для нормального протекания этой цепи реакций является близость внутри хромосомы нормальных аллелей и их порядок, обепечивающий последовательность звеньев в цепи реакций. Вполне понятно, что мутация любого из нормальных

Генетика с основами биометрии

локусов будет прерывать или нарушать течение реакций в соответствующих звеньях.

В свете этих представлений понятны различия функций генов в транс- и цис-типах. В случае цис-типа наличие двух нормальных аллелей в одной хромосоме ведет к нормальному появлению сначала вещества А, а затем вещества В. При транс-расположении в одной хромосоме имеется мутация одного псевдоаллеля (а), а в другой – другого (b). В одной хромосоме наличие мутации (а) ведет к образованию недостаточного количества вещества А, вследствие чего не образуется достаточного количества вещества В. В другой

– наличие мутантного аллеля (b) не дает нормальной реакции А→В, вследствие чего также не образуется достаточного количества вещества В (<В). В результате характер взаимоположения псевдоаллелей в паре

НаÏолесÃÓосновании этих, а также ряда других опытов Люис высказал предположение, что действие трех псевдоаллелей биторакс связана с

гомологичных хромосом определяет их функции, что показано на схеме:

Наличие цепи пос доват ьных р акций представляется очень вероятным в свете данных ряда работ и особенно исследований Люиса по псевдоаллелям бит ракс у дрозофи ы, которые вызывают преобразование груди (торакса) у имаго. Известны спонтанные мутации в трех рядом расположенных псевд аллеля: биторакс (bx3), ультрабиторакс (ubx+) и битораксоид (bxd+). цепь реакций: box+→ubx+→bxd+. Это представление было подтверждено данными по хромосомным перестройкам. Так, разрывы, которые отделяют box+, bud+, bad не изменили действия аллелей bx+ и ubx+, но вели к появлению крайнего проявления признаков bxd. Причиной этого был разрыв цепи реакций, так как удаление нормального аллеля bxd+ от соседнего

локуса ubx+ не позволило завершиться последнему звену в цепи реакций.

наличием трех веществ А, В и D, действие которых зависит от их концентрации. Последовательность реакций, начинающихся с использования исходного субстрата (С), имеет такой вид:

Генетика с основами биометрии

превращению субстрата С в вещество А, нормального аллеля ультрабиторакс (ubx+) вызывает реакцию А→В и нормального аллеля битораксоид (bxd+) – реакцию: В→О.

Изучение перекреста позволило локализовать эти три локуса в таком порядке:

вызывают изменения метаторакса, переводя его на уровень мезоторакса, в результате чего галтеры превращаются в образования, похожие на крылья, развитие которых характерно для структур мезоторакса. Аллели битораксоид (bxd, bxd100) также рецессивны, они вызывают сходные изменения метаторакса, и, кроме того, первый абдоминальный сегмент изменяется до уровня развития метаторакса, в результате на этом брюшном сегменте может развиваться пара ног (выросты метаторак а). Такие о оби вместо шести имеют восемь ног. Аллель ультрабиторакс (ubx)доминантный, у гетерозигот он вызывает небольшое увелич ние галт ров, в гомозиготах летален.

АллелиÏолесÃÓбито ракс (box, box3, bx34l) рецессивны, они в разной степени

Люис следующим образом объяснил разное проявление признаков в

основных комбинациях тр х пс вдоа й биторакс:

В первом случае проявление мутации связано только с изменением галтеров, причина этого – заметное уменьшение количества вещества В. В этом генотипе одна хромосома содержит нормальные аллели, в результате все

Генетика с основами биометрии

три вещества (ABD) появляются в нормальном количестве. Однако заметное уменьшение вещества в другой хромосоме создает некоторую его недостаточность в целом. Во втором случае хотя состав генов тот же, однако налицо проявление рецессивной мутации биторакс, так как блокировка реакций имеет место в обеих хромосомах. Эта блокировка уменьшает количество вещества В, так как в одной хромосоме имеется резкое уменьшение количества этого вещества (<<В) в силу действия мутации bx, в другой – среднее уменьшение его количества (<В) из-за действия мутации bx34l. Признаки битораксоида здесь не проявляются, так как количество вещества D (<<D и <D) снижено еще недостаточно. В особях третьего генотипаÏолесÃÓпроявляются признаки рецессивной мутации битораксоид, так как уменьшение количества вещества D достигает соответствующего уровня (<<D <<D). У этих особей количество вещества В находится на таком уровне, когда признаки мутации биторакс еще не проявляются (В и <<В). У особей четвертого генотипа благодаря снижению ниже порога нормы как вещества В (<В и <<В), так и вещества D (<<D и <<D) появляются комбинации признаков двух рецессивных мутаций — биторакс и биторак оид.

Объяснение различий между цис- и транс-типами сделано на основании того, что вещества А, В и D не диффундируют в заметных количествах из данной хромосомы к гомологичной хромосоме. В противном случае генетическая изом рия не оказывала бы воего влияния. Однако в некоторых случаях диффузия все же им т место. Этот факт установлен Люисом в его работе по новому типу эфф кта положения. Люис показал, что большинство хромосомных п р стро к, у которых хотя бы один разрыв прошел в люб м месте между окусом биторакс и центромерой, т. е. на огромном участке хр м с мы, содержащем более 500 дисков, вызывают эффект пол жения в транс-типе и не изменяют действие генов в цис-типе. Известно, что хр м мные перестройки нарушают конъюгацию гомологов. У дрозофилы благ даря тесн му сближению гомологов при соматической конъюгации создается возможность проникновения вещества из одного в другой. Если это имеет место, тогда нарушение конъюгации, ведущее к пространственному разобщению нормальных аллелей, локализованных в транс-типе в разных хромосомах, должно приводить к нарастанию проявления мутационных признаков. Это и было показано в экспериментах Луиса.

Слабые аллели бито ракс и битораксоид (bх и bxd) не проявляют псевдоаллелизма в транс-структурах. В этих случаях имеет место обычная картина рецессивности мутаций вне зависимости от их расположения в гомологичных хромосомах. В этом случае имеем:

Генетика с основами биометрии

Лишь в случае использования сильных аллелей (bx3, bx34l, bxd100) имеет место псевдоаллелизм, как это было показано выше.

Отсутствие эффекта положения в транс-типах у слабых аллелей биторакс и битораксоид свидетельствует, что в этих случаях взаимодействие между гомологами таково, что диффузия веществ обеспечивает перенос достаточногоÏолесÃÓколичества предшественников, чтобы обеспечить цепь реакций, ведущих к нормальному развитию.

Генетика с основами биометрии

4.4 СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ГЕНА

ПЛАН

1.Тонкая структура гена. Работы С. Бензера.

2.Экзонно-интронная структура гена.

3.Сплайсинг и альтернативный сплайсинг.

1. Тонкая структура гена. Работы С. Бензера

Значимым достижением молекулярной генетики является установление

минимальных размеров участков гена, передающихся при кроссинговере, подвергающихся мутации и осуществляющих одну фракцию. Их величины были получены в 50гг. С. Бензером, который в те годы занимался изучением так называемых rII-мутаций бактериофага Т4, поражающего кишечную палочку – Е. Сoli. Эти мутанты дают быстро формирующиеся негативные колонии (бляшки) на бактериальном газоне.

Бензер разработал удобный те т для разделения r-мутантов на три группы (rI, rII и rIII) по способно ти образовывать бляшки определенной формы на различных линиях кишечной палочки. В частности, те r-мутанты, которые дают большие, круглые, прозрачные бляшки на штамме В и не дают

бляшек вовсе на штамме K12 (λ), являют я rII-мутантами (рисунок 1).

ÏолесÃÓ

Тип колоний, образу мых фагом Т4 на газоне E. Сoli

Рисунок 1 – Тип колоний, образуемых фагом Т4на газоне Е. coli

Очевидно, это позволяет предельно просто выделять из популяции rII фагов все обратные мутанты, т.е. восстановившие свою способность лизировать клетки Е. Сoli K12 (λ).

Выделив несколько сотен rII-мутантов, Бензер для построения генетических карт предпринял всевозможные скрещивания их между собой.

Генетика с основами биометрии

Основой для картирования служил широко применяемый в классической (а теперь и в молекулярной) генетике метод трехфакторного скрещивания (метод трех точек). В результате Бензеру удалось с большой точностью расположить в пределах одного rII-гена несколько сотен различных мутаций.

Среди различных внутригенных мутаций Бензер выделил два класса: точечные мутации (мутации минимальной протяженности) и делеции (мутации, занимающие достаточно широкую область гена). Для точной локализации мутации Бензер использовал не только скрещивание точечных мутантов между собой (рисунок 2), но и метод перекрывающихся делеций.

При скрещивании точечного и делеционного мутантов рекомбинанты появляютсяÏолесÃÓтолько тогда, когда делеция не затрагивает участок, в котором локализована точечная мутация.

Рисун к 2 – Скрещивание точечных мутантов

Устан вив факт существования точечных мутаций, Бензер задался целью определить минимальную длину участка ДНК, передаваемую при рекомбинации. Оказалось, что эта величина составляет не более нескольких нуклеотидов, т. . нескольких мономеров полимерной молекулы ДНК. Бензер назвал эту величину реконом.

Следующим этапом было установление минимальной длины участка, изменения которого достаточно для возникновения мутации, иными словами, определение минимального размера точечной мутации (мутона). По мнению Бензера, эта величина равна нескольким нуклеотидам. Однако последующими тщательными определениями было выявлено, что длина одного мутона не превышает размеров одного нуклеотида.

Оставалось выяснить, что представляет собой на молекулярном уровне третья характеристика гена – управление одной функцией. Для выяснения

Генетика с основами биометрии

затрагивают ли две мутации одну и туже или разные единицы функции, он предложил использовать цис-транс тест, изобретенный Е. Льюисом. Согласно этому тесту мутации попарно испытывают в гетерозиготе в двух конфигурациях: цис – когда обе мутации в гибриде происходят от одного родителя, и транс – когда они поступают в гибрид от разных родителей (рисунок 3).

Согласно С. Бензеру, сли цис- и транс-гетерозигота имеют одинаковый (дикий) фенотип, то мутации затрагивают разные единицы функций, а если цис- и транс-гетерозиготы разного ф нотипа (цис – дикий, а транс –

мутантный), то мутации затрагивают одну диницу функции, которую он предложил называть цистроном.

Следующим важным этапом в изучении организации генетического материала было п дразде ение всех генов на два типа: регуляторные гены – детерминируют стр ение регуляторных белков (репрессоров) и структурные гены – кодируют стр ение стальных полипептидных цепей. Эта идея, а также ее экспериментальн е д казательство были разработаны французскими

исследователями Ф. Жакобом и Ж. Моно.

2. Экзонно-интронная структура гена.

При изучении первичной структуры, т.е. последовательности

нуклеотидов, ряда генов выяснилось, что в них, имеются участки, которые

ничего не кодируют, т. . они подобно межгенным спейсерам (участкам между

ÏолесÃÓРисунок 3 – Цис - транс те т по картированию мутаций

генами) не содержат генетической информации. Группы ученых, возглавляемых Р. Робертсом и П. Шарпом, обнаружили такие расщепленные гены у аденовируса 2 в 1977 г.

Не кодирующие участки получили название интронов, кодирующие – экзонов.

Экзоны – участки ДНК, несущие генетическую информацию и

Генетика с основами биометрии

отвечающие за синтез определенных участков белков.

Такой тип структурной организации обнаружен для множества генов, локализованных в хромосомах эукариот, для некоторых генов внутриклеточных органелл эукариот – пластид и митохондрий, а также для генов нескольких РНК-содержащих и ДНК-содержащих вирусов, поражающих эукариот.

Количество экзонов, приходящихся на один ген, как правило, коррелирует с размером самого гена (таблица 1).

Так, ген инсулина, размер которого равен 1,4 Кб, имеет всего три экзона, а ген коллагена VII типа, длина которого 31 Кб, содержит 118 экзонов. Исследование экзов у 10 наиболее изученных модельных объектов показало, что у эукариот в среднем один ген содержит 3,7 интрона на 1 т.п.н. кодирующего участка ДНК. У низших эукариот, таких как дрожжи, 95% генов содержат только один экзон, значит, такие гены не прерываются интронами. У дрозофилы таких генов всего 17%, а у млекопитающих – 6%.

оснований. Однако и здесь возможны вариации. Например, известны очень длинные экзоны: экзон 11 гена BRCA1 рака молочной железы имеет длину 3,4 Кб, а экзон 26 гена apoB – 7,6 Кб. Экзоны имеют, как правило, небольшую длину.

Интроны – участки ДНК, которые не несут генетической информации, относящейся к синтезу белка, кодируемого данным геном.

У бактерий интронов в генах нет. Нет интронов и в генах вирусов,