(несколько тыс. атмосфер) без изменения жизнеспособности и устойчивы к действию протеолитических ферментов, поэтому трипсин очень часто используется для очистки вирусных вакцин(например, вируса оспенной вакцины) от балластных (белковых) веществ.

По отношению к эфиру и дезоксихолату все вирусы делятся на чувствительные и нечувствительные, что определяется наличием или отсутствием липидов в суперкапсиде.

В целом можно сказать, что вирусы значительно отличаются между собой по устойчивости к вредным воздействиям. Следует помнить, что в чистой культуре вируса всегда есть примесь тканевого белка. И большая устойчивость вируса может зависеть от вида примеси.

Факторы внешней среды (среда обитания) оказывают мощное влияние на вирусы и обусловливают изменчивость их признаков, передающихся по наследству.

Задача 3. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСОВ.

Для этого надо знать:

1.В световом микроскопе доступна изучению морфология только наиболее крупных вирусов, размеры которых превышают 200 нм. Они могут быть окрашены по Романовскому-Гимзе и обнаруживаются при иммерсионной микроскопии. Крупные вирусы могут быть обнаружены при фазово-контрастной микроскопии.

2.Менее крупные вирусы, не достигающие величины 200 нм, при помощи особых способов обработки с протравой и импрегнацией, приводящих к увеличению размеров вируса, становятся видимыми при световой микроскопии

симмерсионной системой. Самым лучшим способом является обработка серебрением по Морозову: для протравы используют жидкость Руге(ледяная кислота + формалин) и раствор танина с карболовой кислотой при подогревании, а

затем проводят обработку раствором азотнокислого серебра с последующим его восстановлением. Под микроскопом вирусы имеют черный цвет и круглую форму. При обработке по способу Морозова можно обнаружить вирус оспы (тельца Пашена), которые достигают размеров 0,2 мкм.

3.Если облучить вирусы ультрафиолетовыми волнами, а затем сфотографировать их при помощи микронасадки, удается получить снимки вирусов, имеющих размеры около 75 нм.

Для обнаружения вирусов используется и люминесцентная микроскопия, основанная на способности некоторых веществ преобразовывать короткие невидимые ультрафиолетовые лучи в длинные видимые волны.

4.Электронная микроскопия позволила быть доступными наблюдению

частицы размером в 1 нм. При этом контраст между частицами и средой удалось увеличить, создавая тени при помощи опыления мазка препарата тяжелыми металлами. При помощи электронной микроскопии обнаружено большое

34

5.В тканях, пораженных вирусами, нередко формируются вирусные скопления. Эти скопления вирусных частиц называютвирусными тельцами или вирусными включениями. Они окрашиваются специальными методами и изучаются с помощью светового микроскопа. Образование внутриклеточных включений отмечено при многих вирусных инфекциях. Чаще они обнаруживаются только в определенной ткани, но при некоторых заболеваниях встречаются в разнообразных тканях. Они могут находиться в цитоплазме клетки(вирус оспы), в ядре (вирус герпеса) или в ядре и в цитоплазме(вирус кори). Включения имеют разную величину (от 0,25 до 20-30 нм) и форму (круглая, овальная, грушевидная, веретенообразная, неправильная).

6.Строение включений и их расположение в клетках всегда характерно для определенного возбудителя вирусной инфекции, поэтому их обнаружение используется с диагностической целью. Например, при бешенстве в цитоплазме нервных клеток (преимущественно в ткани аммонова рога) обнаруживаются тельца Бабеша-Негри. Они полиморфны (чаще всего имеют круглую форму),

водной клетке обнаруживаются одно или несколько телец разнообразной формы. При натуральной оспе в цитоплазме эпителиальных клеток обнаруживаются тельца Гварниери овальной, грушевидной, веретеновидной или серповидной формы. Вирусные включения обнаружены и при ряде других вирусных заболеваний.

7.Для выявления внутриклеточных включений пользуются специальными методами обработки мазков или срезов из тканей. Включения можно получить в эксперименте при заражении вирусами экспериментальных животных. Их можно выявить и в культуре тканей при искусственном выращивании вирусов.

8.Вопрос о природе внутриклеточных включений окончательно не изучен. В большинстве случаев включения содержат значительное скопление вирусных частиц, выявляемых под электронным микроскопом, что позволяет рассматривать включения как колонии вируса. Путем триптического переваривания или другими способами включения удается раздробить наэлементарные тельца и последними вызвать заболевания в эксперименте с образованием в тканях типичных включений. В отношении телец Бабеша-Негри при бешенстве считают, что эти тельца – результат выпадения ядерных коллоидов.

Задача 4. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ МОРФОЛОГИЮ И СВОЙСТВА БАКТЕРИОФАГОВ.

Для этого надо знать:

1.Бактериофаги ("пожиратели бактерий") – это вирусы, паразитирующие

вбактериальных клетках. Их размер колеблется в пределах от 20 до 200 нм, т.е.

втех же пределах, что и размеры вирусов. Как и вирусы, бактериофаги проходят через бактериальные мелкопористые фильтры(т.е. являются фильтрующимися агентами) и способны размножаться только в живых молодых бактериальных клетках.

35

2. Бактериофаги широко распространены в природе и находя повсеместно там, где встречаются бактерии. Они могут быть выделены из воды, почвы, молока; их можно обнаружить в организме людей и животных. При кишечных заболеваниях бактериофаг можно выделить из испражнений больных; при других инфекциях он выделяется из соответствующего материала(из гноя, мокроты и т.д.). Особенно легко он выделяется в период выздоровления.

Кроме бактериофагов обнаружены вирусы грибов, актиномицетов; они получили общее название – фаги.

3. С помощью электронного микроскопа показано, что большинство бактериофагов имеют форму головастика или сперматозоида от20 до 800 нм. Они состоят из головки (65-100 нм) и хвостового отростка (100-200 нм). Отросток представляет собой стержень, одетый чехлом, способный сокращаться, и заканчивается шестиугольной пластинкой с короткими шипами, от которых отходят фибриллы, определяющие специфичность адсорбции фага на бактериальной клетке. Внутри головки находится двунитчатая ДНК, упакованная в виде спирали. Капсид, окружающий ДНК и хвостовой отросток, состоит из белковых субъединиц, уложенных по кубическому или спиральному типу. Белки отростка отличаются от белков головки. Кроме структурных белков в отростке фага имеются ферментные белки – лизоцим и АТФаза, участвующие во взаимодействии с клеткой (растворении стенки клетки-хозяина и сокращении чехла). В головке имеются внутренние геномные белки (в их состав входят полиамины – спермин и путресцин), участвующие в стабилизации структуры ДНК.

Некоторые фаги вместо ДНК содержат РНК; у некоторых – чехол не сокращается. Имеются фаги с короткими отростками(округлой, кубической, палочковидной или нитевидной формы) и без них.

5.Фаги обладают хорошо выраженными антигенными свойствами, в организме на них образуются антитела, нейтрализующие литическую активность фага. Действие антифаговых сывороток строго специфично, следовательно, фаги отличаются друг от друга по антигенным свойствам. У фагов обнаруживаются групповые антигены(общие для родственных фагов) и типоспецифические антигены (строго специфичные). По антигенным свойствам некоторые фаги делятся на серологические группы (например, стафилококковый фаг имеет 6 серогрупп).

6.Бактериофаги более устойчивы к действию физических и химических

факторов, чем бактерии. Хорошо переносят замораживание (-185° С), высушивание, нагревание до +70° С, длительно хранятся при низких температурах, в запаянных пробирках сохраняются годами, а при доступе воздуха разрушаются через 6-8 недель. В спирту, эфире, хлороформе фаг заметно не меняется; 0,5 % раствор сулемы и 1 % раствор фенола не оказывают на него влияния. 1 % раствор формалина инактивирует фаг через несколько минут; губительно действует глицерин в больших концентрациях, УФ-лучи, ионизирующее облучение. Бактериофаги обладают большой чувствительностью к кислотам. Это следует учитывать при энтеральном назначении фага с лечебной или профилактической целями (для нейтрализации HCl желудка назначается сода).

Фаги обладают способностью приспосабливаться к условиям окружаю-

36

щей среды (температура и .)др и адаптироваться к другим вида бактерий, изменяя свою специфичность. Например, брюшнотифозный фаг последовательными пересевами на дизентерийной культуре можно сделать активным в отношении последних. Можно получить фаг, устойчивый к высоким концентрациям глицерина. Известны варианты фагов устойчивые к действию антифаговых сывороток.

Задача 5. ОПИСАТЬ ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БАКТЕРИОФАГОВ С КЛЕТКОЙ.

Для этого надо знать:

1.Бактериофагия – это процесс взаимодействия бактериофага с бактериальной клеткой и в переводе означает "пожирание бактерий". Крайнее выражение процесса бактериофагии – лизис бактерий. Явление бактериофагии впервые заметил Н.Ф. Гамалея в 1898 г., наблюдая просветление свежей культуры сибиреязвенной палочки на жидкой среде. Просветление он объяснил лизисом сибиреязвенных бацилл, а действующий фактор назвал бактериолизином.

2.Широкое и систематическое изучение этого явления было проведено

Ф. д¢Эррелем, выделившим в 1917 г. литический агент из испражнений больных дизентерией и назвавшим этот агент бактериофагом. Он установил, что капля фильтрата из испражнений выздоравливающего человека, внесенная в пробирку с культурой дизентерийных палочек, вызывала постепенное растворение бактерий (просветление жидкости с культурой). Капля отфильтрованной просветленной жидкости обладала способностью растворять свежую взвесь дизентерийных палочек. Полученная жидкость в ничтожном количестве просветляла новую взвесь и т..д Таким образом, при многократном пассировании через культуру дизентерийных палочек действие литического агента не ослабевало, а значительно усиливалось (феномен Ф. д¢Эрреля), поэтому д¢Эррель сделал заключение, что литический агент – это живой агент, ультрамикроскопический паразит бактерий.

Действие бактериофага наблюдалось и на твердых питательных средах. При смешивании литического агента с бактериями на фоне сплошного бактериального роста на агаровой среде можно было увидеть стерильные пятна круглой или неправильной формы. Эти стерильные участки возникали на месте лизиса бактерий и были названы д¢Эррелем "негативными колониями" бактериофага.

Т.к. выделение бактериофага Ф. д¢Эррелем совпало с периодом выздоровления, он рекомендовал бактериофаг для лечения инфекционных заболеваний. В 1927-1928 гг. он применил фаг во время эпидемии холеры в Индии: для уничтожения вибрионов вливал в колодцы по30-40 мл бактериофага. Среди населения, пользовавшегося водой из этих колодцев, смертность снизилась с 62

%до 8%.

3.Размножаются бактериофаги только в живых бактериальных клетках. В основном, стадии взаимодействия фага с клеткой такие же, как и у вирусов: адсорбция, проникновение в клетку, синтез НК и белков, морфогенез, выход из клетки. Но имеются особенности. Фаги обладают еще более строгой специфич-

37

ностью взаимодействия. Определенный фаг взаимодействует определенным видом или подвидом бактерий(это послужило основанием для их наименования по видовым или родовым названиям чувствительных к ним бактерий: стафилофаги, дизентерийные фаги Флекснера). На бактерии адсорбируется много фагов, но для лизиса клетки достаточно одного вириона. Интересен процесс проникновения фагов с хвостовыми отростками в клетку. Эти фаги адсорбируются при помощи фибрилл, после чего активируется АТФаза, и сокращается чехол, в результате наблюдается внедрение стержня в клетку(в этом участвует также фермент лизоцим). ДНК проходит через полость хвостового стержня и активно впрыскивается в цитоплазму клетки. Капсид и отросток остаются вне клетки. Уже через 5 минут начинается синтез НК, а затем и белков, а через 30-40 минут микробная клетка лизируется, и в окружающую среду поступает около 200 новых фаговых частиц.

4.Различают: а) поливалентные фаги – взаимодействуют с родственными видами бактерий; б) моновалентные – взаимодействуют с одним определенным видом; в) типовые фаги – взаимодействуют с отдельными вариантами (типами) данного вида бактерий.

5.Фаги делятся на вирулентные и умеренные. Вирулентные фаги проникают в клетку, размножаются в ней и вызывают ее лизис. Умеренные фаги проникают в клетку, встраиваются в хромосому бактерии и реплицируются вместе

сгенами бактерии (т.е. передаются по наследству), не вызывая лизиса. Встроенный в хромосому бактерии фаг называется профагом. Бактериальные клетки, содержащие профаг, называются лизогенными, а само явление – лизогения. Лизогенные культуры не отличаются от исходных по основным свойствам, но имеют: а) иммунитет к последующему заражению этим же фагом; б) дополнительные свойства (образование токсинов, измененные антигенные свойства), обусловленные генами фага. Изменение свойств бактерий под влиянием профага называется фаговой конверсией. Под влиянием УФ лучей и химических веществ профаг может превращаться в полноценную фаговую частицу, т.е. в вирулентный фаг. Это явление называется индукцией фага.

Если умеренный фаг переходит в вирулентную форму, он может захватить часть хромосомы бактерий и при лизисе перенести эту часть в другую бактериальную клетку. Если эта клетка станет лизогенной, то она приобретет новые свойства. Таким образом, умеренные фаги – мощный фактор изменчивости микроорганизмов.

Умеренные фаги могут нанести вред микробиологическому производству: культуры микроорганизмов, используемые для производства вакцин, антибиотиков, могут стать лизогенными, и в результате появляется опасность, что профаг превратится в вирулентную форму(индукция фага) и лизирует весь штамм.

Задача 6. ОПИСАТЬ ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИОФА-

ГОВ.

Для этого надо знать:

1. Бактериофаги очень широко распространены в природе, они обнару38

желтого цвета). Фаги также выпускают в виде таблеток с кислотоустойчивым покрытием, в форме мазей, аэрозолей и свечей (готовят из фильтратов).

3.На препаратах бактериофага обязательно указывается титр фага или количество фаговых частиц в единице объема или 1в мг (или в 1 таблетке) препарата.

Количество фаговых частиц можно определить путем посева на чувствительную бактериальную культуру, растущую сплошным газоном на плотной питательной среде. В результате размножения фага, вызывающего лизис бактерий, образуются "стерильные пятна" ("бляшки") – негативные колонии фага (они имеют характерную для данного фага форму). Число колоний равно числу фаговых частиц, т.к. один фаг инфицирует одну бактериальную клетку, а стерильное пятно образуется уже в результате его репродукции.

4.Титр фага – наибольшее разведение фага, которое способно еще вызывать лизис чувствительных к нему бактерий.

Титрование – установление титра – можно осуществить на жидких и плотных питательных средах. Для этого препарат бактериофага разводят от 10-1 до 10-9 и более. К каждому разведению добавляют одинаковое количество суточной бульонной культуры соответствующих бактерий. Титр определяется после выдерживания в термостате по просветлению бульона в последней пробирке. Например, если первые шесть пробирок остались прозрачными, а в после-

дующих разведениях и в контрольной пробирке имеется рост культуры, то титр фага 10-6. При титровании на плотных средах разведения фага наносят на засеянную сплошным газоном бактериальную культуру. Титр определяется по последней чашке, где еще имеются "стерильные пятна". В медицинской практике

39