МОЛБИОЛ 2014-лекции / ООФ / Л04_РЕПЛИКАЦИЯ
.pdf
Взаимодействие гамма- и дельтасубъединиц в гамма-комплексе при посадке скользящего зажима ДНК-полимеразы III E. coli
F.P. Leu and M. O'Donnell (2001). J. Biol. Chem., 276 (50): 47185-47194
Эукариотические ДНК-полимеразы
|
Субъединичная |
функции |
Процес- |
|
|
структура |
сивность |
||
|
|
|||
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
Гетеро-мультимер |
Репликация запаздывающей цепи |
высокая |
|
(одна СЕ – |
Участие в репарации ДНК |
|||
|
праймаза) |
|
||
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
Заделывает короткие бреши в |
|
|
|
Мономер |
двунитевой ДНК |
низкая |
|
(40 кD) |
Завершение фрагментов Оказаки |
|||
|
|
|||
|
|
Участие в репарации и рекомбинации |
|
|
|
|
|
|
|
|
Тетрамер |
Репликация митохондриальной ДНК |
высокая |
|
(4 х 50 кD) |
||||
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
Репликация ведущей цепи. |
|
|
|
Гетеро-мультимер |
Нуждается во вспомогательном белке - |
Очень |
|
ядерном антигене пролиферирующих |
высокая |
|||
|
|
клеток (PCNA) |
||
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
Гетеро-мультимер |
Репликация ведущей цепи |
Очень |
|
Не нуждается в PCNA |
высокая |
|||
|
|
|
||
|
|
|
|
Эукариотическая репликативная машина очень
похожа на бактериальную
Эукариотические ДНК-полимеразы (репликация запаздывающей цепи) и ( ) (репликация ведущей цепи) работают координированно.
Вспомогательные белки полимераз:
-увеличивают процессивность;
-имеют корректирующую активность: 3’-> 5’ экзонуклеазы (в основном для );
-связываются с однонитевыми ДНК: факторы репликации А
(аналог SSB) и C (RFA и RFС).
Врепликации участвует сходный набор других ферментов: хеликазы, топоизомеразы, РНКаза Н, и 5’ -> 3’ экзонуклеаза, ДНК-лигаза.
Отличия от прокариот:
Праймаза – одна из субъединиц ДНК-полимеразы.
Уэукариот до 1000 молекул репликаз на геном.
Проблема репликации теломер – концов эукариотических хромосом
|
|
|
Недореплицированные концы |
|
T-loop |
|
|
|
|
|
|
•Репликация конца запаздывающей цепи не может пройти полностью: после удаления РНК-затравки ни одна ДНК-полимераза не сможет восстановить ее 5’- конец. В хромосоме остаются выступающие 3’- концы.
•В каждом цикле деления теломеры клетки укорачиваются. Этот феномен носит название концевой недорепликации и является одним из важнейших факторов биологического старения.
•Теломеры имеют особое строение: они содержат простые некодирующие G-богатые повторяющиеся последовательности из 6-8 п.о. с выступающим 3’- концом, способные сворачиваться с образованием петли (теломерная петля, T-loop).
Длина теломерной ДНК как счетчик времени
1966 г – гипотеза А. Оловникова (2-ой Мед): Постепенное укорочение ДНК хромосом с каждым раундом репликации может лежать в основе ограниченного потенциала удвоения нормальных соматических клеток («лимита Хайфлика»). Длина теломерной ДНК – счетчик времени, определяющий старение клетки.
•Укорочение ДНК в ходе каждого раунда репликации (концевая недорепликация) в пределах «лимита Хайфлика» сокращает длину простых повторяющихся последовательностей теломеры, но не приводит к утрате смысловых последовательностей - генов и регуляторов их экспрессии.
•Сокращение длины теломер в ходе пролиферации соматических клеток до критического значения приводит к аресту деления.
•Должен существовать фермент для наращивания теломер.
1971 г. – публикация Оловникова в ДАН и Дж. Уотсона в Nature (что ДНК бактериофага должна укорачиваться при каждом делении клетки за счет некопируемых концевых участков).
Теломеры и теломераза
•Функции теломер:
-Защита от слияния концов линейных ДНК
-Защита концов от деградации нуклеазами
-Создание структурной основы для восстановления недореплицированных концов.
•Восстановление концов линейных ДНК происходит благодаря функционированию специального фермента –теломеразы. В большинстве дифференцированных клеток теломераза заблокирована, однако активна в стволовых и половых клетках.
•Многие типы раковых клеток обладают повышенной активностью теломеразы.
1991 г – экспериментально показано укорочение теломер 1997 г – генно-инженерным путем получена активная теломераза, удлиняющая теломеры – «фермент бессмертия».
2009 г – Нобелевская премия «за открытие того, как теломеры и фермент теломераза защищают хромосомы» Элизабет Блэкберн, Кэрол Грейдер и Джек Шостак (США).
Теломераза – РНК-зависимая ДНК-полимераза
(обратная транскриптаза)
•Достраивает выступающие однонитевые 3'-концы линейных молекул ДНК хромосом короткими G-богатыми
повторяющимися последовательностями.
•Помимо белковых субъединиц теломераза содержит специальную РНК, выполняющую роль матрицы для
наращивания ДНК комплементарными повторами.
•Длина теломеразной РНК колеблется от 150 нуклеотидов у простейших до 1400 нуклеотидов у дрожжей; у человека - 450 нуклеотидов.
•Теломераза активна в клетках зародышевой линии и в раковых клетках.
•Теломераза репрессирована в соматических клетках.
Теломеразная РНК человека
Center for Cancer Research Nanobiology Program
Репликация теломер в гаметогенезе
Укороченная запаздывающая цепь
Удлинение ведущей цепи ДНК по матрице теломеразной РНК
На новом теломерном повторе синтезируется РНК-затравка для запаздывающей цепи
Узнавание и достраивание теломеры теломеразой по матричной области теломеразной РНК
Дополнительные слайды