МОЛБИОЛ 2014-лекции / ООФ / Л04_РЕПЛИКАЦИЯ
.pdf
Сравнительные характеристики ДНК-полимераз E. сoli
|
Pol I |
|
|
|
Функция |
(фермент |
Pol II |
Pol III |
|
|
Корнберга) |
|
|
|
|
|
|
|
|
Полимеризация в |
+ |
+ |
+ |
|
направлении 5' -> 3' |
||||
|
|
|
||
|
|
|
|
|
Экзонуклезная |
+ |
+ |
+ |
|
активность 3' -> 5' |
||||
|
|
|
||
|
|
|
|
|
Экзонуклезная |
+ |
- |
- |
|
активность 5' -> 3' |
||||
|
|
|
|
|
Молекулярная масса |
109 |
120 |
>1000 |
|
(кДа), |
гетеромультимер |
|||
|
|
|||
четвертичная |
мономер |
мономер |
(10 типов СЕ, |
|
структура |
22 полипептида) |
|||
|
|
|||
|
|
|
|
|
Число оборотов |
600-700 |
35 |
30 000 |
|
(н/мин) |
||||
|
|
|
||
|
|
|
|
|
Число молекул на |
250-400 |
100 |
10-20 |
|
клетку |
||||
|
|
|
•Pol I заделывает бреши при репликации остающей цепи: удлиняет фрагменты Оказаки с 3'-конца и расщепляет РНК-затравки с 5'-конца;
•Pol I и Pol II участвуют в репарации;
•Pol III – репликаза с высокой процессивностью (>5000).
Активности ДНК-полимеразы I Е.coli
•ДНК-полимераза I способна гидролизовать спаренный 5'-конец, «расчищая себе дорогу» и продолжая полимеризацию (реакция «ник-трансляции», результат 5’->3’ экзонуклеазной и полимеризующей активности).
•Если на пути фермента встречается короткий (меньше 10 нуклеотидов) неспаренный 5'-конец, то полимераза сначала отщепляет его (эндонуклеазная активность), а затем проявляет экзонуклеазную 5' - > 3' активность.
При мягком расщеплении ДНКполимеразы I Е.coli трипсином можно получить два активных фрагмента:
•больший фрагмент (фрагмент Кленова) обладает полимеразной и 3’ -> 5’ гидролитической (корректирующей) экзонуклеазной активностью;
•меньший фрагмент обладает 5’ -> 3’ гидролитической активностью.
Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I Е.coli в комплексе с ДНК
(схема по данным рентгеноструктурного анализа)
|
|
|
большой палец |
пальцы |
|
|
|
|
|||
пальцы |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ладонь
Полимеризующий (Pol) и корректирующий экзонуклеазный 3' -> 5' (Exo) центры разделены
Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I Е.coli в комплексе с ДНК
(по данным рентгеноструктурного анализа)
Pol
пальцы
Exo (3’ -> 5’ корректирующая активность)
4. Ассиметричный синтез ДНК
а. Ведущая цепь непрерывно синтезируется ДНК-полимеразой III (Pol III). b. В прерывистом синтезе
запаздывающей цепи участвуют:
•праймаза (Dna G)
•ДНК-полимераза III (Pol III),
•ДНК-полимераза I (Pol I): 5’ 3’-
экзонуклеазная и полимеризующая активности на границе
двух фрагментов Оказаки - реакция «ник-трансляции»
• ДНК-лигаза
• Лигаза (Enz) |
Функционирование ДНК-лигаз Е.coli |
|
|
модифицируется путем |
|
|
|
аденилирования по ε- |
|
аминогруппе Lys за счет |
|
расщепления кофактора
NAD
•Активированный интермедиат переносит AMP-остаток на 5’- фосфорильную группу ДНК, активируя ее
•5’- аденилил-ДНК реагирует с 3’ –ОН группой другого фрагмента ДНК с образованием фосфоди - эфирной связи и отщеплением АМР.
NАM (никотинамидмононуклеотид)
ДНК-лигаза млекопитающих аденилируется кофактором АТР. При этом отщеплятся РРi, далее гидролизующийся до двух Рi.
ДНК-полимераза III E. coli функционирует как димер (модель «тромбона»)
PriA (Rep)
(DnaB+DnaG)
PriA – один из компонентов праймосомы
Субъединичный состав ДНК-полимеразы III E. coli
субъе- Мол. диница масса,
кДа
α 130
ε 25
θ 10
τ 71
γ 52
δ и δ’ |
32 |
|
|
β |
40 |
Кол-во |
|
|
|
Процес- |
|
субъе- |
Активности |
|
|||
|
сивность |
||||
диниц |
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
2 |
полимеразная |
10-15 |
|
||
|
|
|
|
(минима |
|
|
|
|
|||
2 |
3’- |
|
-льный, |
||
|
экзонуклеазная |
|
или core, |
||
|
|
фермент) |
|||
2 |
неизв |
|
|||
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
2 |
τ -димер |
40 |
|
||
|
(связывающий |
|
|
|
|
|
белок) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
3 |
γ-комплекс |
|
|
|
|
|
(установщик |
190 |
|
||
|
β-зажима) |
|
|||
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
2 |
(АТР→ADP + P) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
2 |
β-зажим |
> 5 000 |
|
||
|
(скользящий |
|
|
|
|
|
зажим) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Инициация репликации синтезом РНК-затравок праймазой DnaG в репликативной вилке Е. Coli и репликация ДНК-полимеразой III
на ведущей и запаздывающей цепях ДНК
|
|
минимальный, |
β-зажим |
|
|
(скользящий |
|
или core, |
зажим) |
|
фермент |
|
|
|
|
|
|
γ-комплекс (установщик β-зажима)
праймосома
Роль бета-зажима в увеличении процессивности
ДНК-полимеразы III E. coli
•Бета-зажим – гомодимер;
• Двуспиральная ДНК расположена в
отверстии под углом 220
Белок-белковые взаимодействия в β-зажиме сильнее, чем прямые взаимодействия между полимеразой и матричной цепью ДНК