МОЛБИОЛ 2014-лекции / ООФ / Л04_РЕПЛИКАЦИЯ

Первичный отбор ДНК-полимеразой комплементарного матрице dNTP

Отбор комплементарного матрице dNTP начинается с образования канонических Уотсон-Криковских пар.

•Образование таких пар энергетически более выгодно, так как образуются водородные связи, оптимальные по сравнению с другими возможными вариантами.

•Правильно образованный комплекс вызывает конформационное изменение ДНК-полимеразы, что значительно ускоряет реакцию.

•C частотой 10-5 -10-6 могут образовываться и неканонические пары с таутомерными енольными формами оснований (например, пара C-A вместо C-G), что может быть причиной мутации.

Редактирование ДНК-полимеразой ошибочно

включенных нуклеотидов: корректирующая

3'->5'-экзонуклеазная активность

• Многие ДНК-полимеразы (фаговые, бактериальные, ряда животных и вирусов животных) имеют дополнительный активный центр, катализирующий 3'->5'-экзонуклеазный гидролиз:

[dNMP]n + H2O -> [dNMP]n-1+ dNMP

•Его редактирующая каталитическая функция проявляется при кинетической задержке элонгации цепи, возникающей в результате включения некомплементарного 3'-нуклеотидного остатка и возникновения ошибочной пары при первичном отборе.

•Редактирующая активность (proofreading) понижает частоту ошибок почти в 100 раз; в целом у Е.соli (геном 4.6х106 п.н.) 1 ошибка приходится почти на 1000 циклов репликации, у человека (геном 3х109 п.н.) – на 1-5 циклов репликации.

Общие свойства ДНК-полимераз

•Не способны расплетать ДНК-дуплекс – нуждаются в однонитевой матрице.

•Могут только удлинять предсуществующую нить ДНК или РНК, но не способны инициировать синтез - потребность в затравке (праймере).

•Однонаправленность (униполярность) синтеза: синтез каждой дочерней цепи ДНК происходит всегда в направлении 5’->3’: нуклеотид добавляется к 3’-OH концу растущей цепи.

•Однонитевая матрица считывается в направлении 3’->5’.

•ДНК-полимеразы содержат несколько так называемых «цинковых пальцев» - это петли из примерно 30 аминокислотных остатков, содержащих 4 остатка Cys (или 2 остатка Cys и 2 остатка His) в хелатном комплексе с ионом Zn2+. На конце «пальца» находятся положительно заряженные АК-остатки (R – аргинин).

Ассиметричный синтез двух цепей ДНК

убактерий и высших организмов

•Вследствие однонаправленности (5’->3’)

синтеза цепей ДНК 3’->5’ родительская цепь может реплицироваться поступательно, а 5’->3’ родительская цепь - только прерывисто (ведущая и запаздывающая цепи). Фрагменты запаздывающей цепи (фрагменты Оказаки) должны быть сшиты ферментом ДНК-лигазой.

•Прерывистость репликации показана для всех организмов, кроме фагов, содержащих одноцепочечную ДНК. У некоторых фагов и вирусов прерывистый синтез идет по обеим цепям.

•На разных нитях корректирующая

Репликация: основные события и участники

1.Связывание белка-инициатора (у E. coli Dna A) с точкой начала репликации (ori ) (инициаторный комплекс) и формирование «открытого» комплекса.

2.Расплетание двойной спирали «предзатравочным» комплексом, включающим:

-хеликазы (ДНК-зависимые АТРазы):

•5’-> 3’ (Dna В + Dna С) – хеликаза запаздывающей цепи,

•3’-> 5’ (PriA, старое название Rep) – хеликаза ведущей цепи;

-SSB (дестабилизирующий белок);

-топоизомеразы (ДНК-гираза).

-ДНК-полимеразы

-ДНК-лигаза

ДНК-хеликазы – запускаемые АТР

молекулярные моторы, вовлеченные в репликацию, рекомбинацию и транскрипцию

PcrA-хеликаза из B. stearothermophilus – мономер, самая малая хеликаза. Расплетание прямо вызывается транслокацией хеликазы от 3‘ к 5' концу ssDNA со скоростью ок. 50н./сек за счет гидролиза АТФ в каталитическом центре. Разрешение 2Ǻ.

Конформационное изменение белков SSB обеспечивает их

прочное коопера-

тивное связывание с нитью ДНК

Перемещение С-концевого flapдомена (flap – клапан, ухо) SSB открывает возможность для прочного кооперативного связывания молекул SSB.

У эукариот аналог – фактор репликации А (RFA)

Репликация: основные события и участники

1.Связывание белка-инициатора (у E. coli Dna A) с точкой начала репликации (ori ) (инициаторный комплекс) и формирование «открытого» комплекса.

2.Расплетание двойной спирали «предзатравочным» комплексом, включающим:

-хеликазы (ДНК-зависимые АТРазы):

•5’-> 3’ (Dna В + Dna С) – хеликаза запаздывающей цепи,

•3’-> 5’ (PriA, старое название Rep) – хеликаза ведущей цепи;

-SSB (дестабилизирующий белок);

-топоизомеразы (ДНК-гираза).

-ДНК-полимеразы

-ДНК-лигаза