Генетическая трансформация соматических клеток млекопитающих
Культуры трансформированных клеток млекопитающих используют для получения различных веществ. Хотя культуры клеток животных, особенно при массовом выращивании, гораздо менее экономичны, чем бактериальные дрожжевые культуры, они обладают существенным преимуществом - способностью осуществлять мелкие, но весьма важные модификации белков - продуктов гена млекопитающих. Например, для эффективного функционирования ряда белков необходимо присоединение к ним цепочек из молекул углеводов или липидов. Образование и присоединение таких цепочек - обычный процесс для клеток млекопитающих, тогда как бактериальная клетка не способна производить подобные модификации.
Помимо создания клеток-продуцентов, трансформация соматических клеток млекопитающих позволяет изучать тонкие механизмы регуляции экспрессии генов и целенаправленно модифицировать генетический аппарат клетки животных, а при необходимости и человека, что имеет огромное значение для медицинской генетики.
Культуры клеток млекопитающих могут оказаться эффективным источником выделения некоторых вирусных антигенов с целью получения вакцин для животных и человека. Получение таких вакцинных культур клеток осуществимо при помощи техники рекомбинантных ДНК и эффективных векторов экспрессии для клеток млекопитающих и человека. При использовании ДНК-вакцин в организм вводится не антиген, а ген, кодирующий синтез этого антигена. Ген встраивается в плазмиду, а плазмида вводится организм путем обыкновенной инъекции.
ДНК-вакцины имеют хорошие перспективы в животноводстве. В стадии клинических испытаний в настоящее время находятся ДНК-вакцины против микоплазм, возбудителя туберкулеза, сальмонеллеза, лейшманиоза.
Развитие злокачественной опухоли в организме обычно подавляет иммунитет. Проблема в том, чтобы подхлестнуть иммунную систему в целом и направить ее действие против раковых клеток. Исследователи из Медицинской школы в Энн-Арборе (Мичиган) придумали метод борьбы с раком. В опухолевые клетки толстой кишки подопытных мышей ввели гены, кодирующие белки другой линии мышей. Это можно осуществить с помощью липосом или вируса. После появления на внешней стороне клеточной мембраны этих белков иммунная система атаковала такие клетки. 20% больных мышей выздоровели, у 70% опухоль уменьшилась, в контрольной группе все умерли. Лимфоциты боролись не только с «меченными» клетками опухоли, но и клетками метастаз, следовательно, иммунная система «проснулась». В настоящее время ведутся эксперименты на людях с раком кожи.
Генетическая трансформация половых клеток животных.
Если вводить ДНК в клетки сформированного организма, изменится лишь небольшое число клеток. В этом случае животное будет химерным, т.е. разные ткани будут иметь разный генотип. Дя изменения свойств всего организма, необходимо изменить геном половых кл или зиготы.
Чаща всего для этого применяют метод микроинъекции ДНК в один или оба ронуклеуса только что оплодотворенной яйцеклетки. Далее зиготы имплантируют суррогатным матерям. Родившимся мышатам делается мол-ген анализ после чего есть шанс выведения чистых линий трансгенных животных. Недостатком метода является его трудоемкость и малая эфективность.
Введение ген конструкции в ЭСК. ЭСК получают из брастоцист, когда число бластомер не превышает 8. они обладают тотипотентностью. Модифицированные клетки культивируют ин витро, после чего вводят в другой эмбрион и имплантируют суррогатной матери. Так же есть возможность выведения чистых линий. При помощи этого метода есть возможность контроля экспрессии гена в бластоцисте, соответственно эффективность метода повышается.
По статистике, получается одно модифицированное животне из 40 зигот мышей, 100 зигот овцы или козы, 1500 зигот коровы. И из полученных животных лишь 50% экспрессируют трансгенный белок или сособны передавать этот ген потомству.
Применение трансгенных животных
Трансгенных животных с введенными вирусными или клеточными онкогенами используют для изучения канцерогенеза.
Возможность получения мышей, мутантных по любому клонированному гену, позволяет исследовать функцию генов. Иногда мутация проявляется по-разному у мышей и у человека, что дает возможность исследовать особенности биологии организмов. Если же мутация проявляется сходным образом, то мутантные мыши представляют удобную модель для изучения патогенеза болезни и методов ее лечения.
Мутантных мышей используют для установления роли наследственных факторов в развитии полигенных болезней, например атеросклероза, и для исследования функции нервной системы.
Крупных трансгенных животных используют для производства препаратов, которые выделяют из молока или крови.
Для выращивания и пересадки органов человеку.
Получение биологически активных соединений на основе методов генной инженерии:
получение инсулина;
получение соматотропина;
получение интерферона.
В настоящее время кишечная палочка (E. coli) стала поставщиком таких важных гормонов как инсулин и соматотропин. Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной железы животных, поэтому стоимость его была очень высока. Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800-1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200 - 250 грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков. В 1978 году исследователи из компании "Генентек" впервые получили инсулин в специально сконструированном штамме кишечной палочки. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот. При соединении их дисульфидными связями образуется нативный двухцепочечный инсулин. Было показано, что он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается. Впоследствии в клетках E. coli был осуществлен синтез проинсулина, для чего на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезировали ее ДНК-копию. После очистки полученного проинсулина его расщепили и получили нативный инсулин, при этом этапы экстракции и выделения гормона были сведены к минимуму. Из 1000 литров культуральной жидкости можно получать до 200 граммов гормона, что эквивалентно количеству инсулина, выделяемого из 1600 кг поджелудочной железы свиньи или коровы.
Соматотропин - гормон роста человека, секретируемый гипофизом. Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной карликовости. Если вводить соматотропин в дозах 10 мг на кг веса три раза в неделю, то за год ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см. Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа: 4 - 6 мг соматотропина в пересчете на конечный фармацевтический препарат. Таким образом, доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон, получаемый этим способом, был неоднороден и мог содержать медленно развивающиеся вирусы. Компания "Genentec" в 1980 году разработала технологию производства соматотропина с помощью бактерий, который был лишен перечисленных недостатков. В 1982 году гормон роста человека был получен в культуре E. coli и животных клеток в институте Пастера во Франции, а с 1984 года начато промышленное производство инсулина и в СССР. При производстве интерферона используют как E. coli, S. cerevisae (дрожжи), так и культуру фибробластов или трансформированных лейкоцитов. Аналогичными методами получают также безопасные и дешевые вакцины.
Генная инженерия растений:
У растений трансформация осуществляется векторными методами с помощью агробактерий и вирусов или методами прямого переноса генов (биобаллистика, электропорация, обработка полиэтиленгликолем, микроинъекция, липосомы)
После введения гена, растительную ткань выращивают на среде ин витро. Среда содержит селективный агент и фитогормоны. Упрощает работу тотипотентность растительных клеток.
Достижения и плюсы ГИ растений:
быстрый результат, в отличие от селекции.
Выводятся растения, устойчивые к вредителям, гербицидам, пестицидам, фитопатогенам и прочим стрессовым факторам.
Проводятся работы по выведению растений, способных вырабатывать витамины и лекарственные препараты, полезные вещества и тд.
Трудности:
геном растений изучен хуже генома млекопитающих.
Не для всех растений удается подобрать условия регенерации. Особенно у злаков.
Часто появляются химерные организмы, не способные к росту и размножению.
Изменение пищевой ценности растений.
полисахариды. Выводится картофель, в котором крахмал будут главным образом в виде амилопектина, т.е. разветвленной формы или только в виде амилозы, т.е. линейной формы. Это имеет значение в пищевой промышленности. Сейчас применяется модифицированный крахмал.
запасные белки. В злаках мало лизина, треонина, триптофана, а в бобах – метионина и цистеина. Так же растения могут производить белки животного происхождения, в частности секреторные иммуноглобулины, моноклональные антитела, предотвращающие кариес, ß-интерферон.
жиры. Был получен рапс, вырабатывающий на 45% больше лауриновой ЖК, которая применяется в производстве шампуней и порошков. Разработка способов синтеза ЖК разной длины и насыщенности может существенным образом отразиться на производстве косметики, кондитерских изделий, смазочных материалов, затвердителей, лекарств, полимеров, диз топлива и тд.
Создание гербицидоустойчивых растений
В новых, интенсивных сельскохозяйственных технологиях гербициды применяются очень широко. Это связано с тем. что на смену прежним экологически опасным гербицидам широкого спектра действия, обладающим токсичностью для млекопитающих и длительно сохраняющимся во внешней среде, приходят новые, более совершенные и безопасные соединения. Однако они обладают недостатком — подавляют рост не только сорняков, но и культурных растений Такие высокоэффективные гербициды, как, глифосат, атразины интенсивно изучаются на предмет выявления механизма толерантности к ним некоторых сорняков. Так, на полях, где широко используют атразин, довольно часто появляются атразинустойчивые биотипы у многих видов растении.
Изучение механизма устойчивости к гербицидам с целью получения методами генетической инженерии культурных растений, обладающих этим признаком, включает следующие этапы: выявление биохимических мишеней действия гербицидов в растительной клетке: отбор устойчивых к данному гербициду организмов в качестве источников генов устойчивости: клонирование этих генов: введение их в культурные растения и изучение их функционирования