Лысак В.В. - Микробиология

ликации), тогда как число копий крупных R-плазмид с молекулярной массой ≥20 МД, как правило, составляет одну-две на хромосому.

Большая часть известных R-плазмид клинических изолятов грамотрицательных бактерий конъюгативна, у грамположительных штаммов выделяют как конъюгативные, так и неконъюгативные R-плазмиды.

Плазмиды резистентности могут контролировать устойчивость к одному или нескольким антибиотикам, причем комбинации антибиотиков могут быть самыми различными.

Для некоторых R-плазмид характерен широкий круг хозяев (возможен их перенос в клетки бактерий разных родов). К таким R-плазмидам относится уже упоминаемая нами плазмида RP4.

Любая конъюгативная R-плазмида несет две группы генов. Первая группа – гены, ответственные за передачу плазмиды путем конъюгации (гены tra), они образуют так называемый «фактор переноса устойчивости» (RTF, resistense transfer factor). Область RTF по своей молекулярной структуре гомологична tra-оперону F-фактора E. coli. Вторая группа – гены, обусловливающие собственно резистентность (r-det).

На примере конъюгативной плазмиды R100 со строгим контролем репликации можно рассмотреть общие особенности строения R-плазмид

(рис. 60).

IS2

tra

Рис. 60. Генетическая карта плазмиды R100

198

ковое заболевание растений, получившее название «корончатый галл». Ti-плазмиды – кольцевые молекулы ДНК длиной до 500 т. п. н. и молекулярной массой в среднем 1,3·108 Д. Относятся к классу конъюгативных плазмид.

После заражения растения бактериями Agrobacterium tumefaciens Ti-плазмиды проникают из бактерий в клетки растения. Далее часть их ДНК, так называемая Т-ДНК, встраивается в хромосому инфицируемого растения. В таком состоянии Т-ДНК вызывает образование опухоли, гиперпродукцию фитогормонов, а также синтез ряда производных аминокислот, которые называются опинами. Опины, выделяемые клетками опухоли, бактерии используют в качестве источников углерода и азота.

Многообразие плазмид не ограничивается вышеупомянутыми примерами. Все они имеют существенное значение для клетки бактерий в том смысле, что определяют ряд ее фенотипических свойств, позволяющих более гибко и быстро реагировать на изменение условий окружающей среды. Кроме того, плазмиды бактерий находят широкое применение при теоретических исследованиях и выполнении ряда практических задач:

1.Широко применяются в генетической инженерии. С их помощью можно получить рекомбинантные молекулы ДНК, вероятность образования которых в природе крайне низка или возникновение их вообще невозможно.

2.Играют значительную роль в эволюции бактерий.

3.Представляют большую ценность как материал для исследования структуры и функционирования генетического аппарата бактериальной клетки.

4.Важны с учетом фенотипов, которые они детерминируют:

•наличие плазмид биодеградации позволяет бактериям развиваться в средах, содержащих необычные или неприродные источники углерода. Такие бактерии используют для биологической очистки сточных вод;

•бактериоциногенность, определяемая в основном наличием плазмид, имеет большое значение для развития популяций бактерий. Бактериоциногенные бактерии подавляют развитие других бактерий, преимущественно обладающих сходными пищевыми потребностями (т. е. родственные виды микроорганизмов), что обеспечивается бактериоцином, который в норме продуцируют отдельные клетки бактериоциногенной популяции. В результате синтеза бактериоцина эти клетки погибают, в то время как большинство клеток сохраняет иммунитет к его действию и вытесняет микроорганизмы других видов, чувствительных к нему. Таким образом, бактерии, имеющие бактериоциногенные факторы, обладают

200

важным селективным преимуществом в условиях микробных ассоциаций, естественно складывающихся в процессе эволюции. Эти селективные преимущества реализуются только на уровне популяции и обеспечиваются ценой гибели отдельных ее особей.

Бактериоциногенные штаммы микроорганизмов используют в медицинской практике для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта. Выпускаются бактериоциногенные препараты: колибактерин (высушенная суспензия живых бактерий антагонистически активного штамма E. coli М-17), бифидумбактерин (высушенная суспензия живых антагонистически активных бифидобактерий), бификол (высушенная суспензия живых антагонистически активных штаммов бифидобактерий и бактерий E. coli М-17) и др. Такие препараты используют в тех случаях, когда антибиотики при чрезмерном их употреблении приводят к нарушениям витаминного баланса, дисбактериозу (нарушению состава естественной микрофлоры кишечника) и т. п.

Бактериоциногенные микроорганизмы используются для типирования штаммов бактерий;

•R-плазмиды обеспечивают бактериям, их содержащим, селективные преимущества по сравнению с бесплазмидными;

•плазмиды, детерминирующие токсинообразование, и бактерии, обладающие такими плазмидами, способны вызывать заболевания у человека, животных и растений;

•Ti-плазмиды обеспечивают трансформацию нормальных клеток растений в раковые. Этим они приносят вред сельскому хозяйству, особенно виноградарству.

7.5. Способы генетического обмена у бактерий

Бактерии для воспроизведения себе подобных особей не нуждаются в партнерах. Их удвоившийся после репликации геном каждый раз передается клетке «по вертикали» в бесконечном ряду поколений. Но наряду с таким, бесполым, способом передачи генов от предков к потомкам у бактерий существует и горизонтальный перенос генов, при котором из клет- ки-донора в клетку-реципиента передается часть генетического материала (хромосомы), в результате образуется неполная зигота, или мерозигота. Затем переданный фрагмент хромосомы донора спаривается с хромосомой реципиента с последующей рекомбинацией. За рекомбинацией следует процесс репликации ДНК и деления клетки, в результате чего возникают клетки, содержащие только рекомбинантную хромосому, которые называются рекомбинантами.

201

Существуют три основных способа обмена генетической информацией, или горизонтального переноса генов: трансформация, трансдукция и конъюгация. Эти процессы отличаются друг от друга способом транспортировки ДНК.

Трансформация – перенос генетической информации, при котором ДНК, выделенная из клетки-донора, поступает в клетку-реципиент. Начальным этапом генетической трансформации является необратимая адсорбция ДНК на поверхности клетки и ее поглощение. К необратимой адсорбции и поглощению ДНК способны лишь клетки бактерий, находящиеся в состоянии компетентности. Последующие этапы, как и при других парасексуальных процессах, связаны с рекомбинацией трансформирующей хромосомной ДНК донора с хромосомой реципиента и пострекомбинационными событиями. Получаемые при этом способе генетического обмена рекомбинанты называются трансформантами. Количество переносимой при трансформации ДНК составляет около 10 т. п. н. Генетическая трансформация у бактерий может осуществляться не только хромосомной, но и плазмидной ДНК.

Трансформация – это не только процесс, происходящий in vitro, она может осуществляться и за счет ДНК, спонтанно выделившейся из клетки без участия экспериментатора. Это спонтанная, или естественная, трансформация. Выход ДНК из клетки обусловлен, главным образом, автолизом и при естественной трансформации бактерия-донор ДНК обязательно погибает. Естественная трансформация является одним из способов горизонтального переноса генов в природных условиях.

Трансдукция –перенос генетической информации (хромосомных генов или плазмид) от клетки-донора к клетке-реци-пиенту, который осуществляется при участии бактериофагов. При трансдукции фрагменты хромосомы или плазмиды должны упаковаться в головку бактериофага; выйти в составе этой фаговой частицы из клетки-донора в результате ее лизиса и попасть в другую клетку (клетку-реципиент) при новом акте заражения. Белковый капсид фаговой головки предохраняет находящуюся в ней ДНК от разрушения внеклеточными нуклеазами. В этом отношении трансдуцирующая ДНК более «сохранна», чем «голая» ДНК, при трансформации. Поскольку адсорбция хвостового отростка фага на рецепторах поверхности клетки видоспецифична, то и перенос генетического материала при трансдукции может происходить, главным образом, между близкородственными бактериями.

При трансдукции размеры переносимого фрагмента ДНК определяются размерами головки бактериофага. Различные фаги могут переносить фрагменты ДНК от 20 до 40 т. п. н. Таким образом, при трансдук-

202

ции передаются как единичные гены, как и сцепленные маркеры. Рекомбинанты, получаемые при данном способе обмена генетической информацией, называются трансдуктантами.

Конъюгация – генетический обмен, сопровождающийся переносом генетической информации от клетки-донора к клетке-реципиенту, который осуществляется при их непосредственном контакте.

При конъюгации перенос генетического материала обеспечивается конъюгативными плазмидами, такими, например, как F-плазмида у бактерий E. coli. Конъюгативные плазмиды содержат tra-опероны, ответственные за перенос (transfer) генетического материала. Ряд генов tra- оперонов определяет синтез половых пилей, другие отвечают за перенос самой плазмиды или мобилизацию переноса хромосомной ДНК из клетки в клетку. Передача плазмиды или хромосомы начинается с однонитевого разрыва в области оriT плазмиды, которая называется точкой начала передачи. Для того чтобы произошла передача хромосомных генов, плазмида F (или другая конъюгативная плазмида) должна интегрироваться в хромосому. Разорванная в области оriT нить ДНК разматывается, и однонитевая ДНК, начиная с 5′-конца, переносится в реципиентную клетку. Одновременно на обеих нитях плазмидной и хромосомной ДНК – и той, которая остается в донорной клетке, и той, которая поступила в клетку-реципиент, – синтезируются комплементарные им нити. Благодаря этому в клетке-доноре восстанавливается целостность хромосомы и F-плазмиды. Заключительной стадией передачи F-плазмиды является рециркуляризация ее ДНК в клетке-реципиенте, а передачи хромосомной ДНК – рекомбинация ее с хромосомой реципиента.

Процесс переноса хромосомных генов при конъюгации может осуществляться также при участии содержащихся в хромосоме конъюгативных транспозонов. Такие транспозоны, кроме генов, отвечающих за транспозицию, и генов, детерминирующих фенотипические признаки, несут tra-гены, напоминающие соответствующие гены конъюгативных плазмид. Конъюгативные транспозоны могут выщепляться из хромосомы, образовывать плазмидоподобные структуры и, как и конъюгативные плазмиды, индуцировать (мобилизовать) перенос мелких плазмид в клетку партнера, а также сами переходить в нее.

Процессы конъюгации, особенно ведущие к передаче плазмид, очень широко распространены среди бактерий. Конъюгация – наиболее эффективный механизм для горизонтального переноса генов в любой среде обитания бактерий. Конъюгировать могут бактерии, весьма далекие в систематическом отношении. Плазмиды, осуществляющие конъюгацию между неродственными бактериями и успешно поддерживающиеся в

203

них, как уже отмечалось, называются плазмидами широкого круга хозяев. Конечно, интеграция переданной хромосомной ДНК в геном реципиента за счет гомологичной рекомбинации при межродовых скрещиваниях практически всегда исключается; однако у бактерий имеются «обходные пути», функционирующие за счет незаконной (или негомологичной) рекомбинации.

Количество переносимой ДНК при конъюгации больше, чем при трансформации и трансдукции. В «мягких» условиях скрещивания может переноситься вся хромосома. Получаемые при этом способе обмена генетической информацией рекомбинанты называются трансконъю-

гантами.

Общими особенностями для всех способов обмена генетической информацией у бактерий являются следующие.

1.Процесс переноса ДНК всегда односторонний, или однонаправленный: от донорных бактерий к реципиентным.

2.Полного обмена генетической информацией не наблюдается, результатом чего является образование мерозиготы

Экзогенота – генетический материал донора

Эндогенота – генетический материал реципиента

Состояние мерозиготы носит относительно непродолжительный характер, в конечном итоге экзогенота должна встроиться в эндогеноту. Если этого не происходит, то экзогенота элиминируется эндонуклеазами клетки-реципиента.

3. Для образования рекомбинантного потомства процесс генетического переноса должен обязательно закончиться рекомбинацией.

Кроме трех основных способов обмена генетической информацией, имеются и другие способы, которые еще недостаточно изучены и не так успешно применяются в лабораторной практике. Одним из таких способов обмена является слияние бактериальных протопластов или (и) сфе-

ропластов. Это так называемый искусственный обмен генетической информацией, так как здесь участвуют не интактные клетки, а протопласты или сферопласты. Исследователь должен сначала получить протопласты или сферопласты из клеток обоих родителей, а на следующем этапе смешать и индуцировать их слияние путем обработки полиэтиленгликолем либо другими агентами. Первичный продукт такого слияния – клетка, объединяющая в себе геномы обоих родительских клеток. Слившиеся протопласты или сферопласты высевают на специальные среды, на которых создаются условия для регенерации их в морфологи-

204

чески полноценные клетки. В процессе последующей рекомбинации возникают стабильные рекомбинанты, совмещающие некоторые признаки обоих родительских штаммов.

Метод слияния протопластов или сферопластов пока успешно применяется только в отношении грамположительных бактерий. В последнее время разработаны условия для слияния сферопластов таких грамотрицательных бактерий, как Pseudomonas, Erwinia и др.

В отличие от конъюгации, трансформации и трансдукции, при которых ДНК передается от донора реципиенту, перенос генетической информации при слиянии протопластов или сферопластов не носит однонаправленного характера, а родительские клетки вносят равноценный вклад в образование рекомбинантов.

7.5.1. Трансформация

Явление трансформации было открыто Ф. Гриффитом в 1928 г. в опытах на пневмококках (Streptococcus pneumoniae) – грамположительных бактериях, относящихся к группе молочнокислых бактерий. Ко времени открытия явления трансформации свойства пневмококков были изучены достаточно хорошо. В частности, было известно, что среди пневмококков одного и того же вида, кроме штаммов, имеющих полисахаридную капсулу, обычно есть и бескапсульные варианты, получающиеся в результате мутаций. Было также установлено, что наличие и отсутствие капсулы определяет некоторые важные свойства клеток. Клетки, обладающие капсулой, растут в виде так называемых S-колоний: слизистых, довольно крупных и с гладкой поверхностью. Бескапсульные клетки дают начало мелким, с неровной поверхностью (шероховатым) R-колониям. За счет наличия капсулы бактерии из S-колоний обладают вирулентными свойствами и вызывают септицемию, размножаясь практически беспрепятственно в организме хозяина так как капсула защищает их от фагоцитирующих клеток. Бескапсульные клетки являются авирулентными. Было установлено, что существует большое число различных штаммов пневмококков, которые отличаются друг от друга по химическому составу полисахаридной капсулы и которые можно различить серологически. Сейчас известно около 70 серотипов пневмококков.

Трансформация была открыта в одном из вариантов опытов по иммунизации мышей вакциной, состоящей из пневмококков, убитых нагреванием при температуре 60–80 ºС. Ф. Гриффит обнаружил, что если мышам подкожно ввести смесь живых бескапсульных клеток (R) и убитых нагреванием вирулентных пневмококков (S), имеющих капсулу, то мы-

205

ши погибают. Из органов мышей при этом можно выделить живые капсульные клетки пневмококков.

S

S

R

Если мышам вводили живые авирулентные (R) клетки пневмококков и убитые вирулентные (S) клетки пневмококков разных серотипов (клетки имели разные антигены), то выделенные из органов мыши капсульные клетки имели измененный серотип – тот, к которому принадлежали убитые S-пневмококки. В контрольных опытах введение по отдельности такого же количества живых авирулентных пневмококков или убитых вирулентных не приводило к появлению живых капсульных форм.

RII

SIII

Чтобы доказать отсутствие случайного загрязнения бескапсульной культуры отдельными капсульными клетками, был поставлен эксперимент с использованием клеток пневмококков, меченых специфическим соматическим белковым антигеном или маркерами лекарственной устойчивости. Известно, что эти свойства клеток изменяются независимо от капсульного полисахарида.

206