2 курс / Микробиология 1 кафедра / Экзамен микробик / vse_metody_MIKROB

Механизм реакции: при взаимодействии антител гемолитической сыворотки с эритроцитами барана (Аг) образуется иммунный комплекс [Аг+Ат] к которому присоединяется комплемент. В результате происходит лизис эритроцитов (гемолиз).

Реакция иммуногемолиза не имеет самостоятельного значения, т.к. все компоненты в ней известны, но используется в качестве индикаторной системы в реакции связывания комплемента.

Реакция связывания комплемента (РСК) – сложная трехкомпонентная реакция. Компоненты: исследуемая сыворотка пациента; диагностикум; комплемент. Индикаторная (гемолитическая) система – гемолитическая сыворотка + эритроциты барана.

Постановка реакции (рис.6): в опытную пробирку помещают исследуемую сыворотку пациента (Ат), диагностикум (известный Аг) и комплемент; оставляют пробирку на 1 час в термостате (370С) для контакта. В другой пробирке готовят индикаторную систему (гемолитическая сыворотка + взвесь эритроцитов барана). Через 1 час инкубации в опытную пробирку добавляют индикаторную систему. Учет реакции производят через 16-18 часов.

а)

б)

Рисунок 6 – Схема положительной (а) и отрицательной (б) РСК

10

Механизм: при положительной реакции в сыворотке больного присутствуют антитела, образуется комплекс Аг+Ати комплемент адсорбируется на этом комплексе. Поэтому, когда в пробирку добавляют индикаторную (гемолитическую) систему, в отсутствии комплемента не происходит реакции иммуногемолиза, и эритроциты выпадают в осадок. При отрицательной реакции (отсутствие соответствующих антител в сыворотке обследуемого) не образуется комплекс [Аг+Ат], поэтому комплемент остается свободным и связывается с гемолитической системой, что приводит к гемолизу (лизису эритроцитов). РСК используется для диагностики бактериальных (сифилис) и вирусных инфекций.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) прямая (рис.7): двухкомпонент-

ная сложная серологическая реакция. Компоненты: диагностическая антимикробная сыворотка (Ат), меченная флюорохромом (изотиоцианат флюоресцеина); исследуемый антиген (бактерии или клетки организма, пораженные виру-

сами) – Аг. Индикатором реакции является флюорохром (*), который светится в УФ-лучах.

Рисунок 7 – Схема реакции иммунофлюоресценции (прямой метод)

Постановка реакции: на фиксированный мазок материала, в котором находится возбудитель (Аг), наносят люминесцирующую диагностическую сыворотку на 10-15 минут, затем сыворотку сливают, препарат промывают водой и микроскопируют в люминесцентном микроскопе. Если исследуемый антиген соответствует антителам сыворотки, они адсорбируются на его поверхности, и наблюдается яркое зеленое свечение клеток возбудителя или клеток, пораженных микроорганизмом. РИФ используется для экспресс-диагностики холеры, сибирской язвы, вирусных инфекций.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) непрямая (рис.8): трехкомпо-

нентная сложная серологическая реакция. Компоненты: диагностическая антимикробная сыворотка (Ат), полученная путем иммунизации кроликов конкретным антигеном; исследуемый антиген (бактерии или клетки, пораженные вирусом) – Аг; антиглобулиновая (антикроличья) сыворотка (АГС), меченная флюорохромом. Содержит антитела против кроличьих иммуноглобулинов. Индика-

тором реакции является флюорохром (*).

Рисунок 8 – Схема реакции иммунофлюоресценции (непрямой метод)

11

Постановка реакции: на фиксированный мазок из исследуемого материала наносят диагностическую антимикробную сыворотку на 10-15 минут. Затем сыворотку сливают, препарат промывают водой и наносят антиглобулиновую (антикроличью) сыворотку, меченную флюорохромом, и повторно промывают. При положительной реакции (если в мазке есть возбудитель) образуется комплекс микроб + антимикробные (кроличьи) антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. При микроскопии в люминесцентном микроскопе наблюдается яркое зеленое свечение клеток возбудителя или клеток, пораженных микроорганизмом. Реакция используется для экспресс-диагностики бактериальных и вирусных инфекций.

Иммуноферментный анализ (ИФА): сложная трехкомпонентная серологическая реакция, используется как для определения исследуемого антигена, так и для определения антител в сыворотке больного.

Компоненты реакции для определения антител в сыворотке больного: известный антиген (диагностикум), сорбированный на твердом носителе (в лунках пластин из полистирола); сыворотка больного (Ат); антиглобулиновая сыворотка против Ig человека, меченная ферментом. Индикатором реакции для визуального наблюдения является пероксидаза – фермент, который действует на субстрат (Н2О2), соединенный с хромогеном.

Техника постановки реакции: в лунки полистироловых пластин с сорбированным диагностикумом последовательно добавляют сыворотку больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом, а затем субстрат (H2O2) с хромогеном. Каждый раз после добавления очередного компонента реакции, лунки пластин промывают для удаления не связавшихся реагентов.

При положительной реакции (наличие антител к данному антигену) образуется комплекс [Аг+Ат], к которому присоединяется антиглобулиновая сыворотка, меченная ферментом. Фермент пероксидаза расщепляет субстрат (перекись водорода), и среда в лунках окрашивается в желто-коричневый цвет за счет хромогена. Интенсивность окраски зависит от количества антигенов и антител, вступивших в реакцию. Реакция используется для диагностики вирусных гепатитов, ВИЧ-инфекции и др.

Практическая работа

1. Постановка и учет РА.

Постановка и учѐт РА на предметном стекле.

На чистое обезжиренное предметное стекло наносят с помощью пипетки каплю агглютинирующей коли-сыворотки и рядом (другой пипеткой) – каплю физиологического раствора. Затем в каплю физ. раствора (контроль антигена) и в каплю агглютинирующей сыворотки стерильной петлѐй вносят исследуемую культуру E.coli, снятую с поверхности скошенного МПА. Внесѐнную культуру тщательно перемешивают петлѐй, чтобы капля жидкости сделалась равномерно

12

мутной. Чтобы ускорить наступление реакции агглютинации, предметное стекло слегка покачивают. При положительной реакции в капле с сывороткой наблюдается образование взвешенных хлопьев и просветление жидкости. В контрольной капле – равномерное помутнение (рис.9).

Рисунок 9 – Схема постановки и учет реакции агглютинации на предметном стекле.

Постановка и учѐт развѐрнутой РА (на примере реакции Райта с бруцел-

лѐзным диагностикумом). Для постановки реакции используют следующие ингредиенты: 1) физ. раствор; 2) сыворотка крови обследуемого; 3) бруцеллѐзный диагностикум. Постановка реакции (табл.3): в штативе устанавливают 7 пробирок. Во все пробирки, за исключением первой и предпоследней (контроль сыворотки), наливают градуированной стерильной пипеткой по 1 мл физ. раствора. Затем из пробирки с основным разведением сыворотки 1/50 берут 3 мл и наливают по 1 мл в 1-ю, 2-ю и в предпоследнюю пробирку.

После этого готовят разведения сыворотки. Для этого 1 мл содержимого 2- ой пробирки переносят в 3-ю, из 3-й пробирки такое же количество в 4-ю, из 4- ой в 5-ю. Из 5-ой пробирки (последней опытной) для сохранения одинакового объѐма (1 мл) во всех пробирках 1 мл содержимого вместе с пипеткой помещают в дезинфицирующий раствор.

Таким образом, разведение сыворотки в первой пробирке соответствует основному еѐ разведению (1/50), а в последующих пробирках получается ряд последовательных двукратных разведений 1:100, 1:200, 1:400, 1:800. Затем во все пробирки, за исключением контроля сыворотки (КС), вносят по 2 капли бруцеллѐзного диагностикума. Последняя пробирка является контролем антигена (КА). Штатив с пробирками встряхивают, ставят на 2 часа в термостат при 37оС, а затем на 18-20 часов при комнатной температуре.

Учѐт результатов реакции начинают с контролей. Реакция может учитываться дальше лишь в том случае, если в пробирках с контролями жидкость остаѐтся совершенно однородной: в контроле антигена – слегка мутной, в контроле сыворотки – прозрачной.

13

Таблица 3 – Схема постановки реакции агглютинации (развернутая).

1,0 в дез. раствор 2 часа при 370С , затем 18-20 часов при комнатной температуре.

Учет:

2.Учѐт реакции преципитации в геле для определения токсигенности дифтерийной культуры.

3.Учет РНГА для диагностики брюшного тифа (по демонстрации).

4.Учет РСК (табл.4) с сывороткой крови двух пациентов при подозрении на сифилис (по демонстрации).

Таблица 4 – Схема учета РСК при подозрении на сифилис

14

Занятие № 11

Тема. Иммунная система организма. Специфическая иммунопрофилактика и иммунотерапия.

Цель занятия. Изучить роль иммунной системы организма в создании проти-

воинфекционного иммунитета. Изучить механизм развития аллергической ре-

акции анафилаксии. Изучить основные препараты для специфической профи-

лактики и специфического лечения инфекционных заболеваний.

I.Теоретические знания:

1.Иммунная система организма человека и ее основные функции. Роль АПК, Т-

и В-лимфоцитов.

2. Иммунный ответ по гуморальному и клеточному типу. Иммунологическая память.

3. Аллергия. Классификация аллергических реакций по времени проявления симптомов.

4. Анафилаксия. Анафилактический шок. Методы десенсибилизации организ-

ма.

5. Инфекционная аллергия. Практическое применение кожных аллергических проб для диагностики инфекционных заболеваний.

6. Иммунопрофилактика и иммунотерапия инфекционных заболеваний. Препа-

раты для активной иммунизации. Виды вакцин.

7. Серотерапия и серопрофилактика инфекционных заболеваний. Виды сыворо-

точных препаратов.

II.Практические навыки:

1.Характеристика препаратов для специфической профилактики и специфиче-

ского лечения инфекционных заболеваний.

1

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЗАНЯТИЮ

1.Иммунная система организма человека и ее основные функции. Роль АПК, Т- и B-лимфоцитов.

Иммунная система организма человека представляет совокупность лимфоидных органов и тканей, предназначенных для распознавания, уничтожения и элиминации (удаления) из организма генетически чужеродных веществ (антигенов). В иммунной системе различают центральные (костный мозг и тимус (вилочковая железа)) и периферические органы (лимфатические узлы, селезѐнка, лимфоидная ткань ротоглотки и кишечника).

В центральных органах иммунной системы происходит созревание и дифференцировка лимфоцитов, в результате чего они приобретают иммунокомпетентность, т.е. способность реагировать на чужеродные вещества. В периферических органах зрелые лимфоциты распознают и обезвреживают антигены.

Основные клетки, участвующие в иммунном ответе: антигенпрезенти-

рующие клетки (дендритные клетки, макрофаги и др.), Т- и В-лимфоциты.

Антигенпрезентирующие клетки (АПК) захватывают микробный анти-

ген, расщепляют (процессируют) его и затем представляют (презентируют) Т-лимфоцитам – хелперам. Антигенпрезентирующей может быть любая клетка организма, несущая на своей поверхности молекулы главного комплекса гистосовместимости I класса (МНСI – major histocompatibility complex (англ.)). Среди АПК существуют так называемые «профессиональные» АПК – три типа клеток, которые, кроме МНСI, несут на своей поверхности молекулы главного комплекса гистосовместимости II класса (МНСII). Такими «профессионалами» презентации являются дендритные клетки, макрофаги и В-лимфоциты.

Т-лимфоциты имеют на поверхности специфические антигенраспознающие рецепторы – TCR (T-cell receptor (англ.)). Кроме TCR, в процессе распознавания микробного антигена также участвуют маркерные рецепторы CD, характер которых зависит от функций Т-лимфоцитов.

CD-молекулы (антигены) располагаются на поверхности клеток иммунной системы и имеют различное функциональное значение. Их используют для идентификации и дифференцировки субпопуляций лейкоцитов (clasters of differentiation – кластеры (группы) дифференцировки). CD-антигены являются рецепторами для взаимодействия между клетками. Эти белковые рецепторы имеют порядковые номера и их присутствие на клетках зависит от функции Т- и В- лимфоцитов.

На основании различий в характеристике CD-маркеров, Т-лимфоциты подразделяют на CD4+ и CD8+.

2

CD4 Т-лимфоциты: к ним относят Т-хелперы активаторы и регуляторные Т-хелперы.

-Т-хелперы (Th, Th1, Th2) – при взаимодействии с АПК специфически распознают микробные антигены с помощью TCR. Одновременно CD4маркерные рецепторы связываются с МНСII для стабилизации взаимодействия Th и АПК. После распознавания антигена Th2 стимулируют иммунный ответ по гуморальному типу, а Th1 – по клеточному типу;

-Т-регуляторы – регулируют интенсивность иммунного ответа, подавляя активность других субпопуляций лимфоцитов.

CD8 Т-лимфоциты: к ним относят цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ). С помощью TCR они распознают антиген, а их CD8-рецепторы связываются с МНСI.

ЦТЛ лизируют клетки организма, зараженные вирусами или бактериями, а также опухолевые клетки. Следовательно, CD8 Т-лимфоциты отвечают за

клеточный иммунный ответ.

В-лимфоциты имеют на своей поверхности антигенраспознающий рецептор – ВCR (B-cell receptor (англ.)), а также маркерные рецепторы CD19-21 и др. После встречи с антигеном активированные В-лимфоциты превращаются в плазматические клетки (плазмоциты), вырабатывающие антитела – Ig

всех классов. Следовательно, В-лимфоциты отвечают за гуморальный

иммунный ответ.

Цитокины – гуморальные факторы системы иммунитета белковой природы. Синтезируются различными клетками организма и регулируют межклеточное взаимодействие. Цитокины, которые синтезируются при иммунном ответе, называются интерлейкинами (ИЛ). Они имеют порядковые номера. Основная функция ИЛ стимуляция клеток, участвующих в иммунном ответе.

Весь процесс возникновения защитных механизмов организма состоит из трех действий: 1) распознавание чужеродного микроба специфическими иммунными клетками, 2) активация этих клеток для получения специфического ответа и 3) возникновение реакций, которые ведут к уничтожению конкретных чужеродных микробов.

Независимо от того, какой чужеродный микроб проник в организм, защищать его будут оба звена адаптивного иммунитета: гуморальный (опосредованный антителами) и клеточный.

2. Иммунный ответ по гуморальному и клеточному типу. Иммунологическая память.

Иммунный ответ по гуморальному типу. Для его осуществления необхо-

димо взаимодействие (кооперация) антигенпрезентирующей клетки – профессиональной АПК, Т-хелперов второго порядка (Th2) и В-лимфоцитов. Этот процесс происходит в несколько стадий (рис.10):

3

4