Иммунохроматографический метод анализа. Преимущества и недостатки.
Иммунохроматографический анализ (ИХА) основан на принципе тонкослойной хроматографии и включает реакцию в биологических материалах между антигеном и соответствующем ему антителом. Проводится анализ с помощью специальных тест-полосок, панелей или тест-кассет (рис. 10.18).
Рис. 10.18. Схема ИХА
Метод основан на сепарации микрочастиц методом парной связки и реакции между антигеном и соответствующим ему антителом в биологических материалах (моче, цельной крови, сыворотке или плазме крови, слюне, кале и т.д.). Данный вид анализа осуществляется при помощи индикаторных полосок, палочек, панелей или тест-кассет, которые обеспечивают быстроту проведения тестирования. ИХА — сравнительно новый метод анализа, который часто обозначается в литературе также как метод сухой иммунохимии, стрип-тест, QuikStrip cassette, QuikStrip dipstick, экспресс-тест или экспресс-анализ. Эти названия связаны с быстротой проведения этого метода анализа.
Принцип действия иммунохроматографического теста состоит в том, что при его погружении в физиологическую жидкость она начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Подвижной фазой в данном случае является физиологическая жидкость. Вместе с жидкостью движутся и антитела с красителем. Если в этой жидкости присутствует исследуемый антиген (гормон, инфекционный или онкологический маркер, токсин), то происходит его связывание как с первым, так и со вторым типом антител. При этом происходит накопление антител с красителем вокруг антител, жестко иммобилизованных в тест-зоне ИХА-полоски, что проявляется в виде яркой окрашенной полосы. Свободные антитела с красителем мигрируют далее вдоль полоски и неизбежно взаимодействуют с вторичными антителами в контрольной зоне, где и наблюдается вторая окрашенная (контрольная) полоса.
Взаимодействие (и окрашенная полоса) в контрольной зоне должно проявляться всегда (если анализ проведен правильно), независимо от присутствия исследуемого антигена в исследуемом субстрате. Результаты определяются визуально через 3—8 мин.
Метод иммунной хроматографии основан на особенном свойстве антител связываться с антигеном специфическим (т.е. избирательным) образом. Это означает, что каждое антитело узнает и связывается только со специфическим антигеном. На этой уникальной особенности антител и основаны все иммунологические методы анализа, в том числе и ИХА. Причем устанавливаемым «антигеном» в данном методе анализа может служить и определяемое в биоматериале антитело к инфекционному агенту или аутоантитела, тогда остальные используемые в тесте антитела будут являться антиантителами.
В ИХА-тестах используется три типа антител:
1) подвижные моноклональные антитела к исследуемому антигену или антителу, конъюгированные («сшитые») с коллоидным золотом — красителем, который можно легко идентифицировать даже в самых малых концентрациях. Эти антитела нанесены вблизи участка погружения тест-полоски в физиологическую жидкость (мочу, кровь);
2) поликлональные антитела к исследуемому антигену или антителу, жестко иммобилизованные в тест-зоне полоски;
3) вторичные антитела к моноклональным антителам, жестко иммобилизованные в контрольной зоне тест-полоски.
Существует два формата ИХА: прямой и конкурентный.
1. В формате прямого (сэндвичного) ИХА используют конъюгат антитела-метка, нанесенный на мембрану для конъюгата. На тестовой полоске иммобилизованы антитела, специфические к конкретному анал иту, а на контрольной линии — антивидовые антитела, специфические к первичным антителам. При внесении образца, содержащего искомое вещество (конъюгат), на мембрану с конъюгатом происходит связывание искомого вещества с конъюгатом Ат-метка. Затем образовавшийся иммунный комплекс попадает в тестовую зону, где он связывается со специфическими антителами, образуя «сэндвич» Ат- Аг-Ат-метка. Далее избыток несвязавшегося конъюгата связывается с антивидовыми антителами на контрольной линии. Выявление двух линий на тест-полоске является положительным результатом теста. При отсутствии аналита в образце конъюгат связывается с антивидовыми антителами только на контрольной линии, образуя одну линию на тест-полоске.
Прямой ИХА используется для выявления возбудителей инфекционных заболеваний, высокомолекулярных соединений — вирусов, в том числе ВИЧ, различных гормонов (например, в тестах на беременность).
2. Формат конкурентого ИХА используется для определения низкомолекулярных соединений. Он основан на конкуренции аналита и иммобилизованного конъюгата аналит: белок-носитель за ограниченное количество центров связывания специфических антител, содержащихся в конъюгате Ат-метка. При нанесении образца, в котором содержится аналит, последний связывается с конъюгатом Ат-метка на мембране с конъюгатом. В дальнейшем иммунокомплекс проходит через тестовую зону, где иммобилизован конъюгат аналит : белок- носитель. Иммунокомплекс не может связаться с этим конъюгатом из-за стерических затруднений: низкомолекулярные соединения обычно имеют одну антигенную детерминанту и, соответственно, иммуноглобулины имеют один центр связывания с антигеном, который уже является занятым аналитом. Впоследствии иммунный комплекс связывают антивидовые иммуноглобулины, находящиеся на контрольной линии. Отсутствие окрашенной полосы в тестовой зоне и наличие окраски в контрольной зоне свидетельствуют о том, что концентрация определяемого вещества в исследуемом образце превышает его пороговое значение для данного теста. При отсутствии в аналите анализируемого вещества в образце конъюгат Ат-метка связывается с конъюгатом Аг: белок-носитель, иммобилизованным в зоне тестовой линии. Свободный конъюгат Ат-метка попадает в зону контрольной линии и связывается там с антивидовыми антителами. Наличие двух окрашенных линий (тестовой и контрольной) является отрицательным результатом анализа.
Вариант конкурентного ИХА используют для выявления низкомолекулярных соединений, в том числе в экстрактах тканей.
Преимуществом метода — быстрота и легкость применения, возможность использования неприборных форматов ИХА с визуальной оценкой результата. Не требуется использования никакого оборудования, а анализ может быть проведен неспециалистом в любых условиях, в том числе «полевых».
Достоинства и недостатки иммунохимических методов.
Достоинства метода:
· Быстрота и простота определения;
· Возможность автоматизации и использования для массовых анализов в полевых условиях;
· Не сложная пробоподготовка;
· Высокая точность;
· Не требуется дорогостоящей аппаратуры.
Недостатками можно назвать узкую специфичность и влияние компонентов матрицы.
ГХ/МС – блок схема и принцип работы
Анализ
микробных маркеров методом газовой
хромато-масс-спектрометрии (по Осипову)
