9.Хромосомные карты.  Цитогенетическая карта  Физическая карта  Рестрикционная карта 2

Генетические карты хромосом — это схема взаимного расположения и относительных расстояний между генами определенных хромосом, находящихся в одной группе сцепления.

Впервые в 1913 — 1915 годах на возможность построения генетических карт хромосом указывают Т. Морган и его сотрудники. Они экспериментально показали, что основываясь на явлениях сцепления генов и кроссинговера можно построить генетические карты хромосом. Возможность картирования основана на постоянстве процента кроссинговера между определенными генами. Генетические карты хромосом составлены для многих видов организмов: насекомых (дрозофила, комар, таракан и др.), грибов (дрожжи, аспергилл), для бактерий и вирусов.

Генетические карты человека используются в медицине при диагностике ряда тяжелых наследственных заболеваний человека. В исследованиях эволюционного процесса сравнивают генетических карты разных видов живых организмов. Помимо генетических, существуют и другие карты хромосом.

Цитологические карты хромосом, схематическое изображение хромосом с указанием мест фактического размещения отдельных генов, полученное с помощью цитологических методов. Ц. к. х. составляют для организмов, для которых обычно уже имеются генетические карты хромосом. Каждое место расположения гена (локус) на генетической карте организма, установленное на основе частоты перекреста участков хромосом (кроссинговера), на Ц. к. х. привязано к определённому, реально существующему участку хромосомы, что служит одним из основных доказательств хромосомной теории наследственности. Для построения Ц. к. х. используют данные анализа хромосомных перестроек (вставки, делеции и др.) и, сопоставляя изменения морфологических признаков хромосом при этих перестройках с изменениями генетических свойств организма, устанавливают место того или иного гена в хромосоме. 

Физическая карта – графическое представление порядка следования физических маркеров (фрагментов молекулы ДНК), расстояние между которыми определяется в парах нуклеотидов.

Физическая карта основана на прямом анализе ДНК и не зависит от частоты рекомбинаций, которая неодинакова в разных областях генома. Она облегчает выделение многочисленных генетических маркеров, выявление и клонирование генов. При составлении физической карты генома человека используются: гибридизация in situ , делеционное картирование и картирование длинных рестрикционных фрагментов , а также выделение искусственной дрожжевой хромосомы или других клонов, содержащих крупные вставки.

В отличие от генетических карт сцепления физические карты генома отражают реальное расстояние между маркерами, выражаемое в парах оснований. Физические карты различаются по степени их разрешения, т.е. по тем деталям структуры генома, которые на них представлены ( рис. II.39 ). Исчерпывающая физическая карта генома человека максимального разрешения будет содержать полную нуклеотидную последовательность всех его хромосом. На другом полюсе физических карт с минимальным разрешением находятся хромосомные (цитогенетические) карты генома.

1 - генетическая карта сцепления, 2 - физическая рестрикционная карта, пробелы обозначают места расщепления ДНК рестриктазами, 3 - физическая карта контигов, показаны перекрывающиеся клоны ДНК, полученные с помощью YAC-векторов, 4 - исчерпывающая физическая карта в виде последовательности нуклеотидов ДНК. На всех картах представлен один и тот же участок хромосомы

Полную, но, к сожалению, пока трудно интерпретируемую информацию о строении гена может дать только определение его первичной структуры, т.е. последовательности составляющих ген нуклеотидов. На практике при исследовании протяженных (до 40 т.п.о.) клонированных последовательностей нуклеотидов, включающих исследуемые гены, прежде всего строят их рестрикционные карты. Рестрикционные карты представляют собой схемы, изображающие взаимное расположение сайтов рестрикции для разных рестриктаз и расстояния между ними. Поскольку каждый сайт рестрикции является не чем иным, как строго определенной последовательностью нуклеотидов ДНК, рестрикционные карты наглядно заключают в себе информацию об особенностях первичной структуры картируемых участков генома.

Для построения рестрикционной карты используют гибридизацию по методу Е. Саузерна. Клонированный фрагмент ДНК отдельно или в составе вектора получают в препаративном количестве, затем его обрабатывают соответствующими рестриктазами и продукты рестрикции разделяют электрофорезом в агарозном геле. Количество образовавшихся рестрикционных фрагментов ДНК, обнаруживаемых после окрашивания бромистым этидием в виде флуоресцирующих полос в ультрафиолетовом свете, соответствует количеству сайтов рестрикции в том случае, если различия в размерах образовавшихся фрагментов ДНК достаточны для их разделения при электрофорезе.

+Размеры рестрикционных фрагментов оценивают путем сравнения их электрофоретической подвижности с таковой фрагментов ДНК известных размеров. Получив информацию о количестве сайтов рестрикции в гене, далее определяют их взаимное расположение. Для этого в качестве зондов выбирают короткие фрагменты ДНК и после введения в них радиоактивной метки их гибридизуют с рестрикционными фрагментами ДНК, которые после электрофоретического разделения в агарозном геле были перенесены на нитроцеллюлозные или нейлоновые фильтры. По завершении гибридизации положение фрагментов ДНК, связавших метку, на фильтрах обнаруживают с помощью авторадиографии. Получение такой информации о принадлежности конкретных фрагментов ДНК, образовавшихся под действием различных рестриктаз, к 5’- или 3’-концевым частям исследуемой последовательности нуклеотидов обычно бывает достаточным для определения взаимного расположения различных сайтов рестрикции на рестрикционных картах.

10. Формулы кариотипов аутосомных анеуплоидий: синдром. Дауна, синдром. Патау, синдром Эдварса, транслокационных форм с. Дауна, с. Патау, синдромы хромосомных делеций: «кошачьего крика», Вольфа – Хиршхорна (см. приложение 1 стр.12). Приведите различные примеры аббераций хромосом (del, t, dup, inv, rob) связанных с генетическими заболеваниями у человека, напишите формулы кариотипов в тетрадь.

«Хромосомные синдромы» Название синдрома	Формы синдромов			Частота встречаемости		Кариотип синдрома
Болезнь Дауна			1:550 – 700 новорождённых среди умственно отсталых детей выявляется 10-12 % больных синдромом Дауна
Простая трисомия по хромосоме 21.		95% всех случаев			47, +21 (ХХ, ХУ)
Транслокация 21 хромосомы на другие (чаще на 15, реже на 14, ещё реже на 21, 22, У- хромосому).		4% всех случаев			46, t 21/15 (ХХ, ХУ); 46, t21/14 (ХХ, ХУ); 46, t21/21 (ХХ, ХУ); 46, t21/22 (ХХ, ХУ);
Мозаичный вариант синдрома.			1% всех случаев
Синдром Патау			1: 6000 новорождённых
Простая трисомия по хромосоме 13		75 % случаев			47, +13 (ХХ, ХУ)
Транслокация (чаще робертсоновская);			20 % случаев
Мозаичный вариант синдрома			5%
Синдром Эдвардса			Частота встречаемости 1: 7000.
- Простая трисомия по хромосоме 18 - мозаичная		90 % случаев 10 % случаев			47, +18 (ХХ, ХУ )
Синдром трисомии по 8 хромосоме			Частота встречаемости 1: 50000.
Трисомия по хромосоме 8 - мозаичный вариант -		16 % случаев 84 % случаев			47, +8 (ХХ, ХУ )
Синдром кошачьего крика	Синдром делеции короткого плеча хромосомы 5 (утрата сегмента р15 ).			Частота встречаемости 1 : 50000.		46, 5р- (ХХ, ХУ)
Синдром Вольфа-Хиршхорна	Синдром делеции короткого плеча хромосомы 4 (сегмент р16).			Частота встречаемости 1: 100000		46, 4р- (ХХ, ХУ)
Синдром Клайнфель-тера			Встречается с частотой 1:500 – 700;
Классическая форма синдрома мозаичные варианты:		80% всех случаев синдрома 20% редко встречается			47, ХХУ, 48,ХХХУ, 46,ХУ/ 47, ХХУ и др.
Синдром трисомии по Х хромосоме
Синдром трипло-Х новорождённых девочек и протекает бессимптомно в раннем детском возрасте		встречается с частотой 1:770			47,ХХХ
Синдром Шерешевского-Тернера			Частота встречаемости 1:1430 новорождённых девочек.
Классический вариант– Возможны частичные моносомии и мозаичные варианты.		55% всех случаев синдрома			45,Х0

Хромосомные перестройки (хромосомные мутации, или хромосомные аберрации) — тип мутаций, которые изменяют структуру хромосом. Классифицируют следующие виды хромосомных перестроек : делеции (утрата участка хромосомы), инверсии(изменение порядка генов участка хромосомы на обратный), дупликации (повторение участка хромосомы), транслокации (перенос участка хромосомы на другую), а также дицентрические и кольцевые хромосомы.

Все хромосомные перестройки могут быть подразделены на сбалансированные и несбалансированнные .При сбалансированных перестройках изменяется порядок сегментов(локусов ,генов) на хромосоме , но не происходит количественных нарушений генетического материала.(Например, инверсия и взаимные транслокации). При возникновении несбалансированных перестроек всегда имеет место нарушение «дозы» определенных сегментов хромосомы. Это сопровождается изменением баланса генов и манифестацией той или иной формы хромосомной болезни.

Примеры заболеваний:

Синдром Вольфа-Хиршхорна (делеция короткого плеча хромосомы 4)

Синдром кошачьего крика (делеция короткого плеча хромосомы 5)

Синдром частичной трисомии по короткому плечу хромосомы 9

+Синдром Прадера-Вилли и Ангельмана.

11.Половой хроматин. Изучение полового хроматина, как экспресс метода в медицине для скрининга (просеивания) хромосомных синдромов в диагностике геномных и хромосомных мутаций при их разделении на аутосомные и гоносомные.

Хроматин половой - небольшое тельце, расположенное на периферии ядра соматической клетки; имеет треугольную, округлую или па-лочковидную форму.

Хроматин половой определяет различие интерфазных ядер у особей разных полов, связан с особенностями структуры или функционирования половых хромосом. Различают Y-хроматин и Х-хроматин. Y-хроматин - структурный конденсированный участок Y-хромосомы, выявляющийся у мужчин в интерфазном ядре с помощью флюорохромов в ультрафиолетовом свете. X- хроматин, или тельце Барра, — интенсивно красящаяся основными красителями структура, представляющая собой инактивированную Х-хромосому.

Инактивация происходит в раннем эмбриогенезе одной из двух Х-хромосом (материнской или отцовской с равной вероятностью), которая стойко сохраняется за данной хромосомой при митотическом (см. Митоз) делении клетки.

Определение хроматина полового используется для диагностики хромосомных заболеваний, в частности при подозрении на хромосомные нарушения, связанные с половыми хромосомами. Наиболее объектами для исследования являются слизистая оболочка щеки, реже влагалища, клетки волосяных фолликулов, околоплодных вод (для пренатальной диагностики пола плода).

При нарушениях полового развития, связанных с увеличением числа половых хромосом, обнаруживается дополнительный хроматин половой. Так, при кариотипе 47, XXX в клетках женщин обнаруживаются два, а при кариотипе 48, XXXY - три Х-хроматина; при кариотипе 47, XYY - два Y-хроматина.

По наличию хроматина полового может быть определён генетический пол ребёнка, что находит практическое применение при диагностике разнообразных клинических форм дисгенезии гонад, гермафродитизма, в судебно-медицинской практике.

Методы анализа на половой хроматин:

1. Вторая Х-хромосома в некоторых клетках инактивирована и спирализована. Ее можно увидеть в виде тельца, локализованного у внутренней поверхности ядерной мембраны.

2. В норме половой хроматин наблюдается только у женщин.

Если у мужчин есть, то это синдром Клайенфельтера.

Если у женщин 2, то это синдром трисомии Х.

Если у женщин нет, то это синдром Шеришевского-Тернера.

В 1949 г. Барр и Бертрам в ядрах нейронов самок кошек обнаружили интенсивно, окрашенную глыбку хроматина. Она имеет треугольную форму и прилежит к внутренней мембране ядра. Далее было установлено, что только одна из двух Х-хромосом в соматических клетках женских особей функционально активна, другая конденсируется (факультативный гетерохроматин), и в интерфазном ядре образует Х-хроматин, или тельце Барра. Этот процесс имеет случайный характер в эмбриональном периоде. В норме у женщин (46, ХХ)– одно тельце Барра, у мужчин (46, ХУ) оно отсутствует. Изменение числа Х-хромосом ведёт к изменению числа телец Барра.

Количество телец Барра всегда на единицу меньше, чем количество половых Х-хромосом в кариотипе. Сумма п Х – 1.

Этот феномен получил название правила СТЮАРТА. Например, если кариотип 47, ХХХ, то три Х-хромосом минус одна, равняется два тельца Барра. Присутствие полового хроматина у мужчин, а также наличие дополнительных или отсутствие телец Барра у женщин характерно для нарушений в системе половых хромосом.

Увеличение числа У-хромосм приводит к увеличению флуоресцирующих телец в интерфазных ядрах, названных У-хроматином.

Разработан экспресс-метод определения полового хроматина в соскобе буккального эпителия слизистой щеки. Материал соскоба, полученный с помощью шпателя, переносится на предметное стекло и окрашивается 1% -ным раствором ацетоарсеина, накрывается покровным стеклом и изучается с помощью светового микроскопа.

Структурные аномалии типа делеций, дупликаций, инверсий, инсерций и транслокаций обозначают как: del(-), dup(+), inv, ins и t соответственно, центрические робертсоновские - rob.Когда необходимо обозначить какой – либо участок при описании аномалий хромосом, то вначале пишут число хромосом в кариотипе, затем номер хромосомы в которой произошла мутация, потом символ плеча (p или q) и знаки плюс или минус записываем после символа плеча. 46,ХХ, del, Х p – женский кариотип с 46 хромосомами и делецией длинного плеча Х – хромосомы. 45,ХХ, rob 15,16 – кариотип с 45 хромосомами и робертсоновской транслокацией, 46,ХУ, t 2,5, q21, q31 –транслокация произошла между сегментами 21 и 31 длинных плеч 2 и 5 хромосом.

Запись АУТОСОМНЫХ АББЕРАЦИЙ:

1. Синдром Вольфа – Хиршхорна – частичная моносомия - делеция(утрата части генетического материала) короткого плеча 4 хромосомы

Формула синдрома Вольфа – Хиршхорна - 46,4 p^–, ХУ, утрата сегмента p 16

2. Синдром«крика кошки» - частичнаямоносомия делециякороткого плеча 5 хромосомы, формула синдрома: 46, 5p^–,ХХ, утрата сегмента p 15

3. Филадельфийская хромосома Ph – делеция 21 хромосомы, впервые описана в Филадельфии. Она выявляется только в клетках кроветворной системы - костного мозга, гранулоцитах. Мутантная клетка вытесняет нормальные кроветворные. У носителей этой мутации развивается хронический миелолейкоз. При синдроме Дауна острый лейкоз возникает в 10 – 20 раз чаще, чем среди общей популяции.

4. Транслокационные центрические робертсоновские - robформы:

синдрома ДАУНА– 46,t 21/21,ХХ; 46,t 21/15,ХУ ( чаще на 15, реже 14, еще реже на 21, 22 и У хромосомы);синдрома ПАТАУ – 46, t 13/13, ХХ; 46,t 13/15,ХУ