4.Основные символы и сокращения для обозначения хромосомных аномалий: обозначения – плеч хромосом, аберраций хромосом, анеуплоидий.

Символика хромосом

Кариотип человека в норме и при хромосомных заболеваниях требуют унифицированной символики хромосом. В настоящее время исследователи всего мира – клинические генетики, невропатологи, педиатры, психологи, психиатры используют «Международную систему для цитогенетической номенклатуры хромосом человека». Согласно последней номенклатуре такие морфологические признаки хромосом, как теломеры, центромеры, специфические полосы по длине хромосомы, используются в качестве сравнительных знаков.

В хромосоме выделяют - короткое – p и длинное - q плечи хромосом. В каждом плече выделяют районы, которые пронумерованы от центромеры к теломере, и сегменты-светлые и темные полосы, например, запись – 6q2,3 указывает на то, что это хромосома 6, длинное плечо q, район 2, сегмент 3. Районы и сегменты на хромосомах проявляются после дифференциального окрашивания хромосом различными методами Q, G, R, C, T.

В номенклатуре существует следующие обозначения для описания нормальных кариотипов 46, ХХ девочка и 46, ХУ мальчик. В начале кариотипа записывается общее число хромосом, включая половые хромосомы. Затем записываем половые хромосомы.

Численные аномалии обозначаются изменением числа хромосом в кариотипе и указанием (+) или (–) той или иной присутствующей или отсутствующей хромосомы. Исключением являются половые хромосомы, при количественных аномалиях которых (+) или (–) никогда не ставятся.

НЕ НАДО:

Причём отсутствие одного из гомологов хромосом или его части (делеция) в кариотипе, несмотря на тип мутации (численной или структурной), носит название моносомии – полной или частичной, а присутствие – трисомии полной или частичной. Полиплоидии отражаются только числом хромосом (69).

Структурные аномалии типа делеций, дупликаций, инверсий, инсерций и транслокаций обозначают как:

del(-)-делеция

dup(+)-дупликация

inv-инверсия

ins-инсерция

t-транслокация (робертсоновские) - rob.

Когда необходимо обозначить какой – либо участок при описании аномалий хромосом, то вначале пишут число хромосом в кариотипе, затем номер хромосомы в которой произошла мутация, потом символ плеча (p или q) и знаки плюс или минус записываем после символа плеча. Например:

46,ХХ, del, Х p(-) – женский кариотип с 46 хромосомами и делецией короткого плеча Х – хромосомы.

45,ХХ, rob 15,16 – кариотип с 45 хромосомами и робертсоновской транслокацией,

46,ХУ, t 2,5, q21, q31 – транслокация произошла между сегментами 21 и 31 длинных плеч 2 и 5 хромосом.

5.Цитогенетический метод и его возможности.

Цитогенетический метод основан на микроскопическом исследовании хромосом –

•кариотипа (индивидуального набора хромосом в норме, и при геномных и хромосомных мутациях)

•полового хроматина

Позволяет выявлять

1. Геномные мутации:

а) полиплоидии,

б) анеуплоидии – трисомии 2п + 1 (с. Дауна, Эдварса, Патау, Клайнфельтера),

- моносомии 2п – 1 (Тернера - Шерешевского),

- нулисомии 2п – 2

в) мозаицизм 46/45 хромосом в группах клеток

2. Хромосомные абберации – транслокации (с. Дауна), делеции (с. «Кошачьего крика», Вольфа - Хиршхорна)

3. Микрохромосомные перестройки при моногенных синдромах (филадельфийская хромосома - делеция 21 хромосомы – миелолейкоз - белокровие)

Цитогенетический метод применяется для:

1. диагностики хромосомных и геномных болезней

2. изучения хромосомных и геномных мутаций

3. определения пола при нарушении половой дифференцировки фенотипа

4. изучения полового хроматина

6.Этапы цитогенетического метода – приготовление и окрашивание препаратов метафазных хромосом: а)подбор клеточного материала б)методы культивирования в)получение препаратов метафазных пластинок с раздельно лежащими хромосомами г)окраска хромосом:  стандартная сплошная рутинная окраска хромосом по методу Гимзе;  дифференциальное окрашивание по методу Гимзе в сочетании с дополнительными процедурами;  использование флуоресцентных красителей (акрихин – иприт);  особые модификации окраски (С – метод, Q – метод, G – метод); д)изучение количества и структуры хромосом.

• Подбор клеточного материала,

• Культивирование соматических клеток на искусственных питательных средах (клетки человека быстро размножаются на питательных средах)

• Добавление ФГА - фитогемагглютинина – стимулятора митоза,

• Добавление колхицина – мутагена разрушающего веретено деления во время митоза, для остановки митоза на стадии метафазы

• Обработка клеток гипотоническим раствором, вследствие хромосомы набухают, рассыпаются и лежат свободно

• Окрашивание хромосом

• Изучение под микроскопом, фотографирование

• Вырезание и построение идеограммы

Основные сведения о морфологии хромосом человека получены при изучении их в метафазах митоза и прометафазе-метафазе мейоза. При этом важно, чтобы количество делящихся клеток было достаточно велико.

Подбор клеточного материала. Культивирование

У человека в большинстве случаев используют препараты из клеток костного мозга, кратковременной культуры крови или из длительной культуры фибробластов кожи. Используют биоптаты семенников, слущенные эмбриональные клетки плода (аминиоцентез), плацетобиопсия (биопсия плода – хорионбиопсия и плаценты).

Наиболее простым и доступным методом является культивирование клеток крови. Пункция костного мозга или биопсия кожи для культивирования фибробластов технически сложнее, и к тому же аспирация костного мозга – весьма неприятная процедура. Препараты из костного мозга имеют, однако, то преимущество, что дают возможность изучать митозы in vivo, вне культуры клеток, а сразу после взятия материала у пациента.

В крови здоровых людей нет делящихся клеток. Однако митоз этих клеток можно стимулировать искусственно, обработав их стимулятором митоза фитогемагглютинином ФГА.

1. Берут один миллилитр периферической крови.

2. Суспензию лейкоцитов выращивают в культуральной среде in vitro 72 часа и затем готовят препараты хромосом.

3. Чтобы остановить клетки в прометафазе, подавляют образование веретена деления веществами с колхицином.

4. Для свободного распределения хромосом в плоскости препарата клетки обрабатывают гипотоническим раствором.

5. Затем каплю суспензии наносят на стекло и окрашивают.

Окрашивание.

Наиболее простой способ окрашивания – простая рутинная сплошная по всей длине хромосомы основным (щелочным) красителем Гимза или 2% - ным ацетоорсеином или ацеткармином. Эти красители окрашивают хромосомы целиком, равномерно и интенсивно. Для выявления численных аномалий хромосом этот метод вполне достаточен.

Для получения более детальной картины структуры хромосом или их сегментов используют различные способы дифференциального окрашивания.

Методы дифференциальной окраски хромосом основаны на действии солевых растворов с определённым Ph, температурным режимом, обработкой ферментами протеазами. Этими методами установлена четкая структурная разнородность хромосом по длине на красящиеся (тёмные - гетерохроматин) и некрасящиеся (светлые - эухроматин) полосы.

Дифференциальное окрашивание приводит к появлению линейного рисунка по длине хромосомы. Рисунок этих полос специфичен, индивидуален для каждой пары хромосом. Рисунок сегментации зависит от особенностей неоднородности целостного комплекса ДНК–белок в разных участках по длине хромосом.

Различные типы сегментов обозначают по методам, с помощью которых они выявляются наиболее отчетливо.

Способы дифференциального окрашивания: Q, G, R, C, T - окрашивание.

а) Q – сегменты (quinacrine, акрихин) – участки хромосом способных связывать флюорохромы, флюоресцирующие (яркое свечение) после окрашивания акрихин – ипритом. Q – сегменты соответствуют участкам богатым АТ парам (55 – 65%) ДНК и содержат тканеспецифические гены, реплицирующиеся во второй половине S – периода интерфазы. Преимущество Q метода состоит в том, что позволяет даже в интерфазном ядре идентифицировать «У» хромосому человека по яркой флуоресценции в виде парных светящихся точек. Для просмотра таких препаратов используют люминесцентный микроскоп.

б) G – сегменты (Gitmsa, Гимза) выявляются при окрашивании красителем Гимза в сочетании с дополнительными протеолитическими процедурами, которые способствуют тому, что краситель адсорбируется наиболее интенсивно на определённых G – сегментах (образуя тёмные диски - гетерохроматиновые участки и светлые - эухроматиновые). Этот метод чаще используют в повседневной работе большинства лабораторий, поскольку он не требует использование флуоресцентного микроскопа. Q и G сегменты совпадают. К разновидностям окрашивания по методу Гимзы относятся R и С – окрашиваемость

в) R – сегменты (reverse, обратные) окрашиваются после тепловой денатурации и располагаются между Q и G сегментами. Окрашенные и неокрашенные сегменты располагаются обратно тому, что наблюдается при G и Q – окрашивании. R – сегменты, соответствуют участкам богатым ГЦ – парам (50 – 60%) ДНК, которые более устойчивы к тепловой денатурации. Они содержат общеклеточные гены, реплицирующиеся в первой половине S – периода интерфазы (на G и Q окрашенных

хромосомах это светлые – эухроматиновые участки). На R – окрашенных хромосомах это тёмные эухроматиновые. Гетерохроматиновые и околоцентромерные районы остаются светлыми

Схематичное изображение дифференциальной G и R окраски хромосом кариотипа человека

G R

г) С– сегменты (constituve heterochromatin, конститутивный гетерохроматин) окрашивают прицентромерные районы хромосом, более устойчивые к химическим и физическим повреждениям. В этих участках ДНК с многократно повторяющимися последовательностями. С – окрашивание позволяет выявить сегменты центромерных участков коротких плеч 13, 14, 15, 21, 22, и У хромосом. Это окрашивание выявляет, структурный, или конститутивный гетерохроматин.

д) Т – сегменты, окрашивание теломерных концевых зон хромосом.

Достижения молекулярной цитогенетики позволили внедрить в клиническую цитогенетику новых технологий, таких как ДНК диагностика, гибридизация нуклеиновых кислот на препарате in siti, а также компьютерных систем для анализа хромосом. ДНК диагностика основана на использовании технологии рекомбинантных молекул ДНК для выявления молекулярно генетического дефекта хромосом.

Анализ фотокариограммы нормального кариотипа человека.

Хромосомы окрашены простым рутинным способом, краситель распределяется равномерно по всей длине хромосомы, поэтому они подлежат группой идентификации.

На фотографии метафазной пластинки (46, ХХ – женский кариотип или 46,ХУ – мужской кариотип) находят хромосомы и обводят (в кружок):

1. первыми выделяют группу G - красным карандашом маленькие акроцентрики группы G 21,22 пары - их 4 - две пары, если это женский кариотип (46, ХХ) или 5 акроцентриков, если это мужской кариотип (46, ХУ) с акроцентрической У хромосомой идендифицируемой с хромосомами группы G.

2. вторыми выделяют группу Д, и обводят синим карандашом крупные акроцентрики группы Д 13–15 три пары аутосом - их 6 .

3. третья группа - выделяют группу Е - коричневым карандашом - их 6 аутосом – 3 пары . Хромосомы группы Е (16 – 18 пары) идентифицируют индивидуально: 16- хромосома – более метацентрик, 17-ая – субметацентрик, 18-ая –более акроцентрическая хромосома. Это хромосомы мелких размеров, они выделяются

4. четвёртая группа - выделяют группу F - зеленым карандашом выделяют маленькие метацентрики группы F 19, 20 пары, их 4 – 2 пары.

5. пятая группа - выделяют группу А. Далее идентифицируют хромосомы группы А: 1-я пара - самые большие метацентрики, 2-я пара хромосом – самые большие субметацентрики и 3-я пары хромосомы большие метацентрики, но меньше первой пары хромосом. Выделяют эти хромосомы черным (простым) карандашом - их 6 – 3 пары.

6. шестая группа - выделяют группу В - фиолетовым. Хромосомы группы В - типичные субметацентрики крупных размеров (4, 5 пары).

7. седьмая группа -- С. Оставшиеся хромосомы - это хромосомы группы С и Х - половые хромосомы подлежат групповой идентификации. Хромосом группы С их 14 аутосом. Они средних размеров, типичные субметацентрики Выделяют эти хромосомы желтым карандашом в последнюю очередь.

Половые хромосомы: Х - хромосому выделяют желтым цветом вместе с хромосомами группы – С.

У- красным цветом – маленький акроцентрик, похож на хромосомы группы G.

Затем на метафазной пластинке подсчитывают общее число хромосом. В нормальном кариотипе человека оно равно 46.

Определяют пол по количеству самых мелких акроцентрических хромосом из группы G и хромосом из группы С:

Если кариотип – 46, ХХ – женский, то в группе С будет 16 хромосом: из них 14 аутосом группы С плюс две половые Х-хромосомы. А в группе G – 4 - акроцентрика

Если мужской кариотип 46, ХУ, то в группе С будет 15 хромосом: 14 – аутосом группы С и одна половая Х-хромосома и в группе G – пять акроцентриков

Идентифицированные хромосомы вырезают, раскладывают по группам. А, В, С, D, Е, F, G, нумеруют пары от 1 по 22 и приклеивают в альбом. Половые хромосомы располагают в конце идеограммы.